Reakcija je indirektna. Indirektna reakcija hemaglutinacije (reakcija indirektne hemaglutinacije) ili reakcija pasivne hemaglutinacije (rpga)

⁰

INDIREKTNA REAKCIJA HEMAGGLUTINACIJE, RNGA
(test indirektne hemaglutinacije)

Metoda za detekciju antigena i antitela, zasnovana na sposobnosti crvenih krvnih zrnaca, na čijoj površini su antigeni ili antitela prethodno adsorbovani, da aglutiniraju u prisustvu homolognih seruma ili odgovarajućih antigena.

Kada se otkriju antigeni, reakcija se pokazuje testom reverzne pasivne hemaglutinacije, a kada se detektuju antitela testom pasivne hemaglutinacije. RNGA je pronašao široku primjenu za identifikaciju seroloških markera infekcije virusom hepatitisa B, posebno HBsAg i antitijela na njega.

Trenutno su razvijene različite metode za proizvodnju dijagnostikuma eritrocita, koje se razlikuju po metodama senzibilizacije eritrocita (koristeći tanin, glutaraldehid, krom klorid, rivanol itd.), njihovim vrstama (ljudski, ovčji, piletini, ćureći itd.). ), opcije za postavljanje reakcije (u mikrotitarskim pločama, u epruvetama, kapilarama, itd.) i bilježenje rezultata (vizuelno i instrumentalno). Komplete za dijagnostiku eritrocita za detekciju HBsAg i anti-HBs proizvode mnoga preduzeća i firme kako u našoj zemlji, tako iu inostranstvu.

Češće se RNGA izvodi u mikrotitarskim pločama, u kojima se prethodno pripremaju razrjeđenja test seruma i kontrolni uzorci. Nakon dodavanja eritrocitnog dijagnostikuma i inkubacije, bilježe se rezultati reakcije. Pozitivnim se smatraju uzorci u kojima dolazi do aglutinacije crvenih krvnih zrnaca, koji izgledaju kao obrnuti „kišobran“. Ako je reakcija negativna, crvena krvna zrnca se talože na dno rupe u obliku prstena ili diska.

Da bi se potvrdila specifičnost dobijenih rezultata, reakcija se izvodi i sa "eksperimentalnim" eritrocitnim dijagnostikom (tj. eritrocitima senzibiliziranim antigenom ili antitijelima) i "kontrolnim" dijagnostikom (tj. eritrocitima koji nisu senzibilizirani antigenom ili antitijelima). Prisutnost pozitivne reakcije na "kontrolni" dijagnostički lijek ukazuje na lažno pozitivnu reakciju. Da bi se eliminisale nespecifične reakcije, test serum se tretira nesenzibilizovanim eritrocitima. Preduslov za provođenje RNGA je reakcija neutralizacije, odnosno potvrdni test.

U poređenju sa metodama kao što su RPG, VIEF i RSK, reakcija indirektne hemaglutinacije ima veću osetljivost (200 - 400 puta). Tako se HBsAg u RPHA može otkriti u koncentracijama od 6-10 ng/ml. Jednostavnost reakcije i brzina (20 - 30 minuta) odredile su široku upotrebu ove metode u službi transfuzije krvi za detekciju HBsAg.

Pored dijagnostike eritrocita za detekciju HBsAg i anti-HBs, razvijeni su dijagnostički preparati za otkrivanje anti-HBc, anti-HBc klase IgM (solid-fazna verzija), HBeAg, antigena virusa hepatitisa A i antitela na njega. , međutim, svi oni nisu našli primenu u praktičnoj zdravstvu.

Početna → Analize → Imunološka metoda → Hemaglutinacijske reakcije (imunološka metoda)

Reakcije aglutinacije zasnivaju se na interakciji reagensa (antitijela) s antigenima koji se nalaze na površini stanica ili stranih čestica. Kao rezultat, formiraju se veliki agregati koji se talože i mogu se vidjeti čak i golim okom. Na ovaj način se krvna grupa određuje prema ABO sistemu, prisutnosti Rh faktora u njoj itd. Ovo je osjetljivija dijagnostička metoda u odnosu na precipitacijske reakcije, budući da zapremina sedimenta (aglutinata) premašuje zapreminu precipitat.

Direktna hemaglutinacija

Reakcija direktne hemaglutinacije (DHR) koristi se za otkrivanje površinskih antigena mikroorganizama i crvenih krvnih zrnaca, kao i antitijela na njih.
Ispitni materijal (krv) se dodaje standardnim serumima koji sadrže antitijela. Brzina reakcije direktne aglutinacije povezana je s količinom materijala koji se testira, količinom i koncentracijom seruma i temperaturom okoline.

Indirektna hemaglutinacija

Reakcija indirektne hemaglutinacije provodi se radi otkrivanja antitijela u krvi pacijenta pomoću dijagnostikuma eritrocita. Reagens se sastoji od crvenih krvnih zrnaca na čijoj površini se nalazi antigen (proteini mikroorganizama, toksini, alergeni itd.).
Krvni serum pacijenta se razblaži sa 0,9% rastvorom natrijum hlorida, zatim se dodaje eritrocitni dijagnostikum i prati se rezultat. Ova vrlo osjetljiva dijagnostička metoda otkriva antigene čak i u malim koncentracijama.

Reakcija hemaglutinacije (HRA).

U laboratoriju se koriste dvije reakcije hemaglutinacije s različitim mehanizmima djelovanja.

Prvi RGA je serološki. U ovoj reakciji, crvena krvna zrnca se aglutiniraju u interakciji s odgovarajućim antitijelima (hemaglutinini). Reakcija se široko koristi za određivanje krvnih grupa.

Drugi RGA nije serološki. U njemu, adhezija crvenih krvnih zrnaca nije uzrokovana

antitijela, već posebne tvari koje stvaraju virusi. Na primjer, virus gripe aglutinira crvena krvna zrnca pilića i zamoraca, a virus dječje paralize aglutinira crvena krvna zrnca ovaca. Ova reakcija omogućava procjenu prisutnosti određenog virusa u materijalu koji se proučava.

Reakcija se provodi u epruvetama ili na posebnim pločama s jažicama. Materijal testiran na prisustvo virusa razrijeđen je izotoničnom otopinom od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml svakog razblaženja se pomeša sa jednakom zapreminom 1-2% suspenzije crvenih krvnih zrnaca. U kontroli se 0,5 ml eritrocita pomiješa sa 0,5 ml izotonične otopine. Epruvete se stave u termostat na 30 minuta, a ploče ostave na sobnoj temperaturi 45 minuta.

Obračun rezultata. Ako je reakcija pozitivna, na dnu epruvete ili bunarčića pojavljuje se sediment crvenih krvnih zrnaca sa zaobljenim rubovima („kišobran“) koji prekriva cijelo dno jažice. Ako je rezultat negativan, crvena krvna zrnca formiraju gust sediment s glatkim rubovima („dugme“). Isti sediment bi trebao biti u kontroli. Intenzitet reakcije se izražava znakovima "+".

Reakcija hemaglutinacije

Titar virusa je maksimalno razrjeđenje materijala u kojem dolazi do aglutinacije.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

Ovo je serološka reakcija u kojoj specifična antivirusna antitijela, u interakciji s virusom (antigenom), neutraliziraju ga i lišavaju mu sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica, odnosno inhibiraju reakciju hemaglutinacije. Ova reakcija vam omogućava da odredite vrstu i vrstu virusa.

Postavljanje reakcije. 0,25 ml antivirusnog seruma pomiješa se sa jednakom količinom materijala koji sadrži virus. Smjesa se promućka i stavi u termostat na 30 minuta, nakon čega se dodaje 0,5 ml 1-2% suspenzije crvenih krvnih zrnaca.

Obračun rezultata. Ako se eksperiment izvede pravilno, treba formirati „dugme“ u kontroli seruma i eritrocita – nema faktora koji aglutinira eritrocite; u kontroli antigena formira se "kišobran" - virus je izazvao aglutinaciju crvenih krvnih stanica. Ako je serum homologan virusu koji se proučava, formira se "dugme" - serum je neutralizirao virus.

Indirektna reakcija hemaglutinacije

Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (RIHA) temelji se na činjenici da crvena krvna zrnca, ako se na njihovoj površini adsorbira rastvorljivi antigen, stiču sposobnost aglutinacije u interakciji s antitijelima na adsorbirani antigen.

Postavljanje reakcije. Serum se zagrijava 30 minuta na 56 °C, razrjeđuje uzastopno u omjeru 1:10 - 1:1280 i sipa se u 0,25 ml u epruvete ili jažice, gdje se zatim stavljaju 2 kapi crvenih krvnih zrnaca sa adsorbiranim antigenima na njima. dodano.

Kontrole: suspenzija eritrocita sa adsorbiranim antigenima na njima sa očigledno imunim serumom, suspenzija eritrocita sa antigenima adsorbiranim na njima sa normalnim serumom; suspenzija normalnih crvenih krvnih zrnaca sa test serumom. U prvoj kontroli trebalo bi da dođe do aglutinacije, u drugoj i trećoj ne bi trebalo da dođe.

Kontrolna pitanja.

1. Šta pokazuje pozitivan rezultat rendgenske analize između crvenih krvnih zrnaca i materijala koji se testira na prisustvo virusa?

2. Hoće li doći do reakcije aglutinacije crvenih krvnih zrnaca ako im se doda virus i odgovarajući serum? Kako se zove reakcija koja otkriva ovaj fenomen?

PRAKTIČNI RAD br. 12.

Reakcija fiksacije komplementa.

Reakcija fiksacije komplementa (FFR) zasniva se na činjenici da specifični kompleks antigen-antitijelo uvijek adsorbira (veže) komplement za sebe.

Ova reakcija se široko koristi u identifikaciji antigena i u serodijagnostici infekcija, posebno bolesti uzrokovanih spirohetama (Wassermannova reakcija), rikecijama i virusima.

RKS je složena serološka reakcija. Uključuje komplement i dva sistema antigen-antitijelo. U suštini, to su dvije serološke reakcije.

Desni glavni sistem se sastoji od antigena i antitela (jedno je poznato, drugo nije). U to se dodaje određena količina komplementa. Ako se antigen i antitijelo ovog sistema poklapaju, oni će se povezati i vezati kompliment. Dobijeni kompleks je fino raspršen i nije vidljiv.

Formiranje ovog kompleksa se otkriva pomoću drugog hemolitičkog ili indikatorskog sistema. Uključuje ovčije crvena krvna zrnca (antigen) i odgovarajući hemolitički serum (antitijela), tj. gotov imuni kompleks. U ovom sistemu do lize crvenih krvnih zrnaca može doći samo u prisustvu komplementa. Ako je komplement vezan prvim sistemom, onda u drugom sistemu neće biti hemolize, jer nema slobodne dopune. Odsustvo hemolize (sadržaj epruvete je zamućen ili se na dnu nalazi sediment eritrocita) evidentira se kao pozitivan RSC rezultat.

Ako u prvom sistemu antigen ne odgovara antitelu, tada se imunološki kompleks neće formirati i komplement će ostati slobodan. Ostajući slobodan, kompliment učestvuje u drugom sistemu, izazivajući hemolizu, rezultat RSC je negativan (sadržaj epruveta je providan - „lakirana krv“).

Komponente, reakcije fiksacije komplementa:

1. Antigen - obično lizat, ekstrakt, hapten,

rjeđe suspenzija mikroorganizama.

2. Antitijelo - serum pacijenta.

3. Komplement - serum zamorca.

4. Antigen - eritrociti ovaca.

5. Antitelo - hemolizin na eritrocite ovaca.

6. Izotonični rastvor.

Zbog činjenice da je veliki broj složenih komponenti uključen u RSC,

moraju se prvo titrirati i reagovati u tačnim količinama iu jednakim količinama: 0,5 ili 0,25, rjeđe 0,2, 1,25 ili 1,0 ml (veći volumeni daju precizniji rezultat). Titracija komponenti reakcije se provodi u istoj zapremini kao i eksperiment, zamjenjujući nedostajuće sastojke izotoničnom otopinom.

Povezane informacije:

Pretražite na stranici:

Indirektni ili pasivni hemaglutinacijski test (IRHA ili RPHA) je osjetljiviji i specifičniji od testa aglutinacije. Ova reakcija se također koristi u dva smjera.

1) Za otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta koriste se kompleti za dijagnostiku eritrocita u kojima se antigen adsorbira na površini eritrocita tretiranih taninom. U odnosu na ovu reakciju češće se koristi termin RPGA.

Test serum se razblaži u jamicama plastičnih ploča i doda se eritrocitni dijagnostikum. Uz pozitivnu reakciju, pojavljuje se tanak film duž zidova rupe u obliku "čipkastog kišobrana" s negativnom reakcijom, pojavljuje se gusti sediment eritrocita u obliku "gumpa".

2) Za otkrivanje toksina i bakterijskih antigena u ispitivanom materijalu koristi se dijagnostika antitijela eritrocita, dobijena adsorpcijom antitijela na eritrocite. U odnosu na ovu reakciju češće se koristi termin RNGA. Na primjer, uz pomoć dijagnostike antitijela otkrivaju se antigen bacila kuge, egzotoksin difterije i egzotoksin botulinuma.

Šta je dijagnostikum eritrocita? Šta je dijagnostikum antitijela eritrocita?

Dijagnostikumi eritrocita su crvena krvna zrnca (tretirana taninom ili formalinom) s antigenima ekstrahiranim iz bakterija adsorbiranih na njima, a koriste se u RPHA (reakcije pasivne hemaglutinacije). U slučaju kada se RPGA koristi za otkrivanje antigena u izlučevinama pacijenata, u tkivima i sl., koriste se „dijagnoze antitijela“, odnosno crvena krvna zrnca senzibilizirana antitijelima.

U RNGA se antitijela u krvnom serumu otkrivaju pomoću antigenskog dijagnostikuma eritrocita, koji je eritrociti na kojima su adsorbirani antigeni.

Metodologija za postavljanje reakcija. Reakcija koaglutinacije.

- fiksacija crvenih krvnih zrnaca sa formaldehidom ili glutarnim ili akrilnim aldehidima. Ovako tretirana crvena krvna zrnca se čuvaju dugo vremena. Češće se u tu svrhu koriste eritrociti ovaca, ljudi, pilića itd.;
— tretman fiksiranih eritrocita otopinom tanina. Kao rezultat toga, crvena krvna zrnca stječu sposobnost da nepovratno adsorbiraju proteine (viruse i antitijela) na svojoj površini;
- senzibilizacija taniziranih eritrocita virusima ili antitijelima.

Reakcija koaglutinacije (CAR)

Reakcija koaglutinacije se koristi za određivanje antigena korištenjem antitijela adsorbiranih na proteinu A stafilokoknih stanica (dijagnostikum antitijela).
Protein A ima afinitet prema Fc fragmentu imunoglobulina, stoga takve bakterije tretirane imunološkim dijagnostičkim serumom nespecifično adsorbiraju serumska antitijela, koja potom stupaju u interakciju s aktivnim centrima s odgovarajućim mikrobima izoliranim od pacijenata. Kao rezultat koaglutinacije nastaju ljuspice koje se sastoje od stafilokoka, dijagnostičkih serumskih antitijela i otkrivenog mikroba.

Aglutinirajući serumi: šta sadrže; kako se dobijaju, za šta se koriste; Koliki je titar aglutinirajućeg seruma?

Aglutinirajući serum se dobija imunizacijom zečeva (intravenozno, subkutano ili intraperitonealno) suspenzijom ubijenih bakterija, počevši od doze od 200 miliona, zatim 500 miliona, 1 milijarda, 2 milijarde mikrobnih tela u 1 ml, u intervalima od 5 dana. 7-8 dana nakon posljednje imunizacije uzima se krv i utvrđuje se titar antitijela.

Titar aglutinirajućeg seruma je maksimalno razrjeđenje seruma pri kojem dolazi do aglutinacije s odgovarajućim mikroorganizmom.

Aglutinirajući serumi se koriste za identifikaciju mikroba u punoj reakciji aglutinacije.

Reakcija hemaglutinacije (HRA)

Ako je ispitivani mikroorganizam aglutiniran serumom do titra ili do polovine vrijednosti titra, može se smatrati da pripada vrsti čiji je naziv naznačen na etiketi ampule.

Koje su razlike između polivalentnih i monovalentnih (monoreceptorskih) aglutinirajućih seruma; Zašto imunizacija zeca mikrobima jedne vrste proizvodi serum koji sadrži antitijela na nekoliko antigena?

Monoreceptorski serumi su serumi koji sadrže antitijela samo na jedan antigen i polivalentni serumi koji daju reakcije aglutinacije sa dvije ili tri srodne bakterije koje imaju zajednički antigen. Aglutinirajući serumi se koriste za identifikaciju mikroorganizama u reakciji aglutinacije. Nedostatak ovakvih seruma je u tome što su sposobni dati reakcije grupne aglutinacije, jer sadrže antitijela na bakterije koje imaju zajedničke antigene.

Reakcija hemaglutinacije. Opis i primjena

Zasniva se na činjenici da crvena krvna zrnca, na kojima se prethodno adsorbiraju antigeni, stiču sposobnost aglutinacije u prisustvu homolognih seruma (antitijela).

U ovom slučaju crvena krvna zrnca djeluju kao nosioci specifičnih determinanti, čija aglutinacija nastaje kao rezultat reakcije antigen + antitijelo.

Crvena krvna zrnca za čiju su površinu antigeni čvrsto vezani nazivaju se eritrocitni antigen diagnosticum, ili eritrociti senzibilizirani antigenom.

Druga vrsta RNGA - antitijela se adsorbiraju na površini eritrocita i njihova naknadna aglutinacija se događa u prisustvu homolognog antigena. U ovom slučaju, takvi eritrociti se nazivaju dijagnostikum eritrocitnih antitijela, ili eritrociti senzibilizirani antitijelima.

Na osnovu ova dva temeljna metodološka pristupa razvijene su i korištene mnoge modifikacije RNGA. Stoga se male standardne čestice lateksa koriste kao nosači. U ovom slučaju, reakcija se naziva reakcija lateks aglutinacije (RLA) ili se koristi Staphylococcus aureus - reakcija koaglutinacije itd. Obično se dijagnostika eritrocita priprema u poduzećima biološke industrije, a glavno iskustvo RNGA provodi se u dijagnostičkim laboratorijama.

Priprema dijagnostikuma eritrocita uključuje sljedeće korake:

fiksacija crvenih krvnih zrnaca s formaldehidom ili glutarnim ili akrilnim aldehidima. Ovako tretirana crvena krvna zrnca se čuvaju dugo vremena. Češće se u tu svrhu koriste eritrociti ovaca, ljudi, pilića itd.;
tretman fiksiranih eritrocita otopinom tanina. Kao rezultat, crvena krvna zrnca stječu sposobnost da nepovratno adsorbiraju proteine (viruse i antitijela) na svojoj površini;
senzibilizacija taniziranih eritrocita virusima ili antitijelima.

Treba napomenuti da su metode za pripremu dijagnostike eritrocita za virusne infekcije različite.

Procedura za izvođenje RNGA za otkrivanje i određivanje titra antitijela je sljedeća:

jednake doze eritrocita senzibiliziranih antigenom dodaju se uzastopnim 2-strukim razrjeđenjima seruma;
smjesa se ostavi 2-3 sata na sobnoj temperaturi ili 16-18 sati na 4 °C;
uzeti u obzir rezultate. Ako serum sadrži antitijela na virus kojim su crvena krvna zrnca senzibilizirana, uočava se hemaglutinacija, koja se procjenjuje u križanjima.

Smatra se da je titar antitijela u serumu najveće razrjeđenje seruma koje još uvijek osigurava hemaglutinaciju pomoću najmanje dva ukrštanja.

RNGA je praćen svim relevantnim kontrolama. Obično se reakcija izvodi mikrometodom.

RNGA vam omogućava da riješite sljedeće dijagnostičke probleme:

detektovati antitijela i odrediti njihov titar u krvnom serumu pomoću poznatog dijagnostikuma antigena eritrocita;
otkriti i identificirati nepoznati virus pomoću poznate dijagnostike eritrocitnih antitijela.

Prednosti RNGA: visoka osjetljivost, jednostavnost tehnike postavljanja i brzina odgovora. Međutim, važno je napomenuti da se javljaju velike poteškoće u pripremi stabilne dijagnostike eritrocita (velika ovisnost o čistoći korištenih komponenti, potreba za odabirom načina fiksacije, tanizacije i senzibilizacije eritrocita za svaku vrstu virusa).

Ako pronađete grešku, odaberite dio teksta i pritisnite Ctrl+Enter.

U kontaktu sa

Direktna reakcija mikrobne aglutinacije (RA). U ovoj reakciji, antitijela (aglutinini) direktno aglutiniraju korpuskularne antigene (aglutanogene). Obično su predstavljeni suspenzijom inaktiviranih mikroorganizama (reakcija mikrobne aglutinacije). Na osnovu prirode formiranog aglutinata razlikuju se granularna i flokulentna aglutinacija. Granularna aglutinacija nastaje kada se mikrobi koji sadrže O-antigen drže zajedno. Bakterije sa flagelama (H-antigen) aglutiniraju i formiraju velike pahuljice.

Za određivanje vrste mikroorganizama koriste se standardni dijagnostički aglutinirajući serumi. Dobivaju se hiperimunizacijom laboratorijskih životinja suspenzijom bakterija. Titar takvog seruma je njegovo najveće razrjeđenje pri kojem se opaža jasna aglutinacija odgovarajućeg antigena. Međutim, zbog složenosti antigenske strukture bakterija, aglutinirajući serumi sadrže antitijela ne samo na specifične, već i na grupne antigene i mogu dati grupnu aglutinaciju sa srodnim vrstama bakterija. Titri antitela na antigene specifične za vrstu u serumu su uvek veći nego na grupne antigene. Za uklanjanje grupno-specifičnih antitijela, mikroorganizmi koji sadrže grupne antigene se uzastopno dodaju u serum (Castellani metoda). Ova metoda proizvodi adsorbirane serume koji sadrže antitijela na određenu vrstu mikroba.

Metode reakcija aglutinacije. Najčešći su lamelarni (približni) i prošireni RA.

Ploča RA se postavlja na staklo. U ovoj reakciji se koriste blago razrijeđeni ili nerazrijeđeni serumi. Koristi se kao ubrzana metoda za detekciju antitijela ili identifikaciju mikroorganizama. Na staklo se nanese kap seruma, u koju se petljom unese nepoznata bakterijska kultura, promiješa se i nakon 2-3 minute uočava se pojava sitnozrnate ili ljuskaste aglutinacije. Za kontrolu se koristi kap fiziološke otopine, u kojoj se nakon dodavanja bakterija opaža zamućenost. Kod upotrebe neadsorbiranih seruma, reakcija na staklu je samo indikativna.

Prošireni RA se izvodi u epruvetama ili pločama. U tom slučaju, dijagnostički serum se razrijedi do titra i dodaju jednake količine antigena. Ako je rezultat pozitivan, na dnu epruvete se formira labav talog u obliku „kišobrana“, ako je rezultat negativan, formira se sediment u obliku „dugme“. Budući da su titri grupno-specifičnih antitijela u serumu mnogo niži od titara specifičnih za vrstu antitijela, grupne reakcije se uočavaju samo u malim razrjeđenjima seruma. Ako se aglutinacija dogodi prije titra ili do polovine titra seruma, to je specifično za vrstu.

Za određivanje antitijela u serumu pacijenta (serološka dijagnoza) koristi se standardni mikrobni dijagnostikum koji sadrži suspenziju poznatih mikroba ili njihovih antigena. U ovom slučaju je također moguće ugraditi ploču i raspoređeni RA.

Direktna reakcija aglutinacije stanica. Za određivanje krvnih grupa koriste se standardni serumi krvi donora koji sadrže poznata anti-A ili anti-B antitijela. Reakcije se izvode na staklu ili pločama. Ako eritrociti imaju A (2. krvna grupa), B (3. krvna grupa) ili oba antigena (4. krvna grupa), odgovarajući serumi aglutiniraju eritrocite. Koristi se i test kompatibilnosti krvi, gdje se miješaju kapi krvi davaoca i primatelja i procjenjuje aglutinacija.

Klinike koriste reakciju aglutinacije leukocita, trombocita i drugih stanica za identifikaciju autoantitijela, kao i za određivanje antigena na tim stanicama.

Reakcija hemaglutinacije zasniva se na fenomenu sljepljivanja crvenih krvnih zrnaca, koje nastaje pod utjecajem različitih faktora. Postoje direktna i indirektna hemaglutinacija.
U reakciji direktne hemaglutinacije, crvena krvna zrnca se lijepe kada se određeni antigeni, kao što su virusi, adsorbiraju na njih.

Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (IRHA, RPHA) temelji se na upotrebi eritrocita (ili lateksa) s antigenima ili antitijelima adsorbiranim na njihovoj površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma pacijenata uzrokuje da se eritrociti zalijepe zajedno i ispadnu na dno epruveta ili ćelija u obliku zupčastog sedimenta.

Komponente. Za izvođenje RNGA mogu se koristiti eritrociti ovaca, konja, zečeva, pilića, miševa, ljudi i drugih, koji se pohranjuju za buduću upotrebu tretiranjem formaldehidom ili glutaraldehidom. Kapacitet adsorpcije eritrocita se povećava kada se tretiraju rastvorima tanina ili hrom-hlorida.

Antigeni u RNGA mogu biti polisaharidni antigeni mikroorganizama, ekstrakti bakterijskih vakcina, antigeni virusa i rikecija, kao i druge supstance.

Crvena krvna zrnca senzibilizirana hipertenzijom nazivaju se eritrocitni dijagnostici. Za pripremu eritrocitnog dijagnostikuma najčešće se koriste ovčiji eritrociti koji imaju visoku adsorbirajuću aktivnost.

Aplikacija. RNGA se koristi za dijagnostiku infektivnih bolesti, određivanje gonadotropnog hormona u urinu pri utvrđivanju trudnoće, za identifikaciju preosjetljivosti na lijekove, hormone iu nekim drugim slučajevima.

U serološkim studijama koristi se direktna reakcija inhibicije hemaglutinacije, kada se virus izoliran od pacijenta neutralizira specifičnim imunološkim serumom, a zatim kombinira s crvenim krvnim stanicama. Odsustvo hemaglutinacije ukazuje na konzistenciju virusa i korišćenog imunološkog seruma.

Reakcija indirektne hemaglutinacije (pasivna hemaglutinacija) se uočava u slučajevima kada se crvenim krvnim stanicama koje su prethodno tretirane (senzibilizirane) raznim antigenima doda imunološki serum ili serum pacijenta koji sadrži odgovarajuća antitijela. Dolazi do specifičnog lijepljenja crvenih krvnih zrnaca, do njihove pasivne hemaglutinacije.

Reakcija indirektne ili pasivne hemaglutinacije superiorna je po osjetljivosti i specifičnosti u odnosu na druge serološke metode, a koristi se u dijagnostici infekcija uzrokovanih bakterijama, rikecijama i protozoama.

Metoda za izvođenje reakcije indirektne hemaglutinacije sastoji se od nekoliko faza.

· Najprije se crvena krvna zrnca ispiru izotoničnom otopinom natrijum hlorida, zatim se, ako je potrebno (kada se koriste proteinski antigeni), tretiraju rastvorom tanina 1:20.000 i senzibiliziraju rastvorljivim antigenima.

· Nakon ispiranja puferovanim izotoničnim rastvorom natrijum hlorida, antigen eritrocita je spreman za upotrebu.

· Test serumi se razblažuju izotoničnom otopinom natrijum hlorida u epruvetama ili specijalnim plastičnim pločama sa jažicama, a zatim se svakom razblaženju seruma dodaje eritrocitni dijagnostikum.

· Rezultati reakcije indirektne hemaglutinacije uzimaju se u obzir prirodom sedimenta crvenih krvnih zrnaca formiranih na dnu epruvete.

· Rezultat reakcije u kojoj crvena krvna zrnca ravnomjerno pokrivaju cijelo dno epruvete smatra se pozitivnim. U negativnoj reakciji, crvena krvna zrnca u obliku malog diska ili "dugma" nalaze se u sredini dna epruvete.

· Nakon 2 sata inkubacije na 37 °C, rezultati se uzimaju u obzir, procjenjujući izgled sedimenta crvenih krvnih zrnaca (bez mućkanja): kod negativne reakcije pojavljuje se sediment u obliku kompaktnog diska ili prstena na dno bunara s pozitivnom reakcijom pojavljuje se karakterističan čipkasti sediment crvenih krvnih zrnaca, tanak film s neravnim rubovima;

Reakcija koaglutinacije.

Ova reakcija se zasniva na jedinstvenom svojstvu Staphylococcus aureus, koji sadrži protein A u svom ćelijskom zidu, da se veže za Fc fragmente IgG i IgM.

U tom slučaju, aktivni centri antitijela ostaju slobodni i mogu stupiti u interakciju sa specifičnim determinantama antigena. Kap 2% suspenzije stafilokoka, senzibilizirane odgovarajućim antitijelima, nanosi se na stakalce i dodaje se kap suspenzije bakterije koja se proučava. Ako se antigen poklapa sa antitijelima, jasna aglutinacija stafilokoka napunjenih antitijelima se javlja unutar 30-60 s.

Zahtjevi za imunološki serum koji se koristi za senzibilizaciju stafilokoknih stanica i provođenje procesa senzibilizacije. Da bi se dobio koaglutinirajući reagens, suspenziju stafilokoka treba tretirati imunim serumom protiv željenog antigena. Serum se mora uzeti od životinje čiji IgG ima afinitet za protein A. Najveći afinitet za njega imaju imunoglobulini ljudi, svinja, pasa i zamoraca, najmanji - magarac i zec, a IgG ovce, konji, pacovi i miševi vrlo slabo reaguju na njega.

Pored stroge specifičnosti za željeni antigen, serum koji se koristi u RCOA ne bi trebao sadržavati antitijela na stafilokok kako bi se izbjegla aglutinacija stafilokoknog reagensa zbog specifičnog djelovanja antigena i antitijela, koja treba isključiti u IgG - proteinu Sistem. Kontrola se vrši miješanjem jedne kapi seruma i 10% suspenzije stafilokoknog reagensa na čaši. Ako se nakon 3...5 minuta ne formiraju ljuspice aglutinata, tada se serum smatra pogodnim za reakciju.

Ako dostupni uzorci seruma na ovaj antigen aglutiniraju stafilokok, tada se mogu adsorbirati suspenzijom stafilokoknih stanica koje nemaju protein A (na primjer, Wood-46 sojevi). Na taj način se uklanjaju antitijela koja reaguju sa stafilokokom zbog Fab fragmenata.

Dakle, serum koji se koristi za pripremu koaglutinirajućeg reagensa mora ispunjavati sljedeće zahtjeve:

dobijeno od životinje koja proizvodi IgG ima afinitet za protein A;
mora imati specifičnost za željeni antigen;
ne sadrže antistafilokokna antitela.

· Priprema dijagnostikuma. Pripremljeni 10% stafilokokni reagens se kombinuje sa jednakom zapreminom imunog seruma u prethodno određenom optimalnom radnom razblaženju. Smjesa se mućka 60 minuta na 40...42 °C u shutgel aparatu pri 90 vibracija u minuti. Zatim, nakon 15 minuta, dva puta se isperu sa PBS-om, resuspenduju do 2% suspenzije i konzerviraju sa natrijum mertiolatom (1:10,000).

Indirektni ili pasivni hemaglutinacijski test (IRHA ili RPHA) je osjetljiviji i specifičniji od testa aglutinacije. Ova reakcija se također koristi u dva smjera.

1) Za otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta koristi se dijagnostika eritrocita, u kojoj se antigen adsorbira na površini eritrocita tretiranih taninom. U odnosu na ovu reakciju češće se koristi termin RPHA.

2) Za otkrivanje toksina i bakterijskih antigena u ispitivanom materijalu koristi se dijagnostika eritrocita antitela, dobijena adsorpcijom antitela na eritrocite. U odnosu na ovu reakciju češće se koristi termin RNGA. Na primjer, uz pomoć dijagnostike antitijela otkrivaju se antigen bacila kuge, egzotoksin difterije i egzotoksin botulinuma.

Coombsov test (aptiglobulinski test)

Reakcija se koristi za otkrivanje nepotpunih antitijela, na primjer, antitijela na Rh faktor. Test serum se dodaje Rh + eritrocitima, u kojima se pretpostavlja prisustvo nekompletnih antitela na Rh faktor. Nakon što su vezana za crvena krvna zrnca, nekompletna antitijela ne izazivaju aglutinaciju, jer imaju samo jedan aktivni centar. Zatim se dodaje antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na ljudske globuline. U kombinaciji s nepotpunim antitijelima, antiglobulinski serum uzrokuje aglutinaciju crvenih krvnih stanica.

Reakcija precipitacije

Suština reakcije je taloženje (precipitacija) antigena pod utjecajem specifičnih antitijela. Za postizanje vidljive reakcije neophodno je prisustvo elektrolita. Antigen u reakciji precipitacije su molekularno raspršene supstance.

Prstenasta reakcija precipitacije smeštene u uske taložne cevi. Imuni serum se sipa u epruvetu i na nju se pažljivo slojevito nanosi test materijal. Ako se u njemu nalazi antigen, na granici dvije tekućine formira se neprozirni prsten precipitata.

Reakcija se koristi u sudskoj medicini za određivanje vrste proteina u mrljama krvi, sjemenu itd.; za određivanje antigena u dijagnozi antraksa (Ascolijeva reakcija), meningitisa i drugih infekcija; u sanitarno-higijenskim studijama - za utvrđivanje krivotvorenja prehrambenih proizvoda. Imunološki precipitirajući serumi se dobijaju imunizacijom životinja odgovarajućim antigenom. Na primjer, serum za taloženje ljudskih proteina dobiva se imunizacijom zeca ljudskim proteinom. Titar precipitirajućeg seruma je najveće razrjeđenje antigena s kojim reaguje. Serum se obično koristi nerazrijeđen ili u razrjeđenju 1:5.

Reakcija precipitacije agar gela izvedeno na nekoliko metoda. To su reakcija dvostruke imunodifuzije, reakcija radijalne imunodifuzije i reakcija imunoelektroforeze.

Dvostruka imunodifuzijska reakcija(prema Ouchterlony). Otopljeni agar gel se sipa u Petrijevu posudu i nakon stvrdnjavanja u nju se izrezuju udubljenja. U neke jažice se stavlja antigen, a u druge imuni serumi koji difundiraju u agar i formiraju talog u obliku bijelih pruga na mjestu susreta.

Radijalna imunodifuzijska reakcija(prema Mancini). Imuni serum se dodaje u otopljeni agar gel i sipa u šolju. Nakon što se agar stvrdne, izrezuju se jažice i u njih se stavljaju antigeni koji, difundirajući u agar, formiraju prstenaste precipitacijske zone oko jažica. Što je veća koncentracija antigena, to je veći prečnik prstena. Reakcija se koristi, na primjer, za određivanje imunoglobulina različitih klasa u krvi. Imunoglobulini klasa IgG, IgM, IgA djeluju kao antigeni u ovoj reakciji, a antitijela protiv njih nalaze se u specifičnim monoreceptorskim serumima.

Imunoelektroforeza. Elektroforeza proteinskih antigena se provodi u agar gelu. Precipitirajući serum se uvodi u žljeb, koji ide paralelno sa smjerom kretanja proteina. Antigeni i antitijela difundiraju u agar i na mjestu susreta formiraju se precipitacijske linije.

Reakcije imunološke lize

Antigen (eritrociti ili bakterije), kombinujući se sa specifičnim antitijelima, formira imuni kompleks za koji se veže komplement (C1), a komplement se aktivira klasičnim putem. Aktivirani komplement lizira crvena krvna zrnca (hemoliza) ili bakterije (bakterioliza). Reakcija bakteriolize se koristi za identifikaciju Vibrio cholerae.

Reakcija hemolize. Antigen u reakciji su eritrociti, antitijela (hemolizini) se nalaze u hemolitičkom serumu. Hemolizini se vežu za crvena krvna zrnca i aktivira se komplement koji lizira crvena krvna zrnca. Zamućena suspenzija crvenih krvnih zrnaca pretvara se u prozirnu jarko crvenu tekućinu - „krv laka“. Pošto se reakcija hemolize javlja samo u prisustvu komplementa, ona se koristi kao indikator za detekciju komplementa.

Lokalna reakcija hemolize u gelu(Erne reakcija) - varijanta reakcije hemolize. Služi za određivanje broja ćelija koje stvaraju antitijela (AFC) u slezeni i limfnim čvorovima.

Otopljeni agar gel se pomiješa sa suspenzijom stanica slezene i crvenih krvnih zrnaca, a nakon što se agar stvrdne, dodaje se komplement. Oko svake ćelije koja proizvodi hemolizin formira se zona hemolize. Broj ćelija koje proizvode hemolizin određen je brojem takvih zona.

Reakcija se provodi radi otkrivanja antigena patogena u ispitivanom materijalu dodavanjem imunološkog seruma u njega. U prisustvu homolognog antigena antitela se vezuju, pa nakon dodavanja eritrocita senzibilisanih antigenom ne dolazi do njihove aglutinacije, što se ocenjuje kao pozitivan rezultat. Da bi reakcija bila osjetljivija, test materijalu se dodaje specifični imunološki serum u minimalnoj količini (2 hemaglutinirajuće jedinice). Titar imunološkog seruma se prvo određuje pomoću RNGA. Jedna hemaglutinirajuća jedinica je maksimalno razrjeđenje seruma koje uzrokuje da se crvena krvna zrnca drže zajedno.

Metodologija. Dodajte 0,025 ml 1% rastvora normalnog zečjeg seruma u jažice polistirenskih ploča ili epruveta za aglutinaciju i napravite serijska 2-struka razblaženja ispitivanog materijala. Zatim se u sve jažice doda 0,025 ml imunog seruma, ploča se protrese i ostavi 30 minuta na temperaturi od 37ºC ili 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim u sve jažice dodati 0,025 ml antigenskog dijagnostikuma, promućkati i ostaviti 2 sata, nakon čega se rezultati uzimaju u obzir.

Prilikom izvođenja ove reakcije, kontroli za RNHA se dodaje kontrola specifičnosti imunološkog seruma, koja se sastoji od specifičnog antigena, imunološkog seruma (2, 1, 0,5 hemaglutinirajuće jedinice) i suspenzije senzibiliziranih eritrocita.

RTNGA se također koristi za otkrivanje specifičnih antitijela (potpunih i blokirajućih), za koje se u test serum dodaje dozirana količina antigena. Ako sadrži antitijela, onda su vezana antigenom, dakle, nakon dodavanja eritrocita senzibiliziranih antitijelima (2. faza RTNGA), eritrociti se ne lijepe.

Zahvaljujući upotrebi minimalne količine antigena (2 neutralizirajuće doze), reakcija je vrlo osjetljiva. Broj neutralizirajućih doza u preparatu antigena određuje se pomoću RNGA, dok se serijska 2-struka razrjeđenja antigena rade u 1% otopini normalnog zečjeg seruma i u jažice se dodaje dijagnostikum antitijela eritrocita. Neutralizirajućom dozom antigena smatra se njegovo maksimalno razrjeđenje, koje daje potpunu adheziju senzibiliziranih eritrocita.

Prije reakcije, test serumi se razblaže 1:5-1:10 i inaktiviraju na temperaturi od 56°C 30 minuta. Za adsorpciju hemaglutinina serumu se dodaje 50% suspenzija formaliniziranih ili svježe opranih ovčijih eritrocita u količini od 0,1 ml suspenzije na 1 ml razrijeđenog seruma. Smjesa se protrese i inkubira 30 minuta na 37ºC ili 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se crvena krvna zrnca precipitiraju centrifugiranjem. Serum možete ostaviti u frižideru do sledećeg dana da se crvena krvna zrnca talože.

Prilikom izvođenja eksperimenta, ispitivani materijal se razrijedi u 1% otopini normalnog zečjeg seruma u zapremini od 0,025 ml u jažice mikrotitarske ploče. Zatim se u svaku jažicu dodaju 2 neutralizirajuće doze antigena u zapremini od 0,025 ml. Ploče se protresu i ostave 30 minuta na 37 °C ili 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim se u sve jažice doda 0,025 ml eritrocitnog dijagnostikuma antitela. Ploče se protresu i inkubiraju 1,5-2 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega se uzimaju u obzir rezultati reakcije. Računovodstvo se može obaviti i narednog dana. Titar test seruma smatra se njegovim maksimalnim razrjeđenjem pri kojem se crvena krvna zrnca ne lijepe.

Eksperiment je popraćen sljedećim vrstama kontrole:

1) stabilnost senzibiliziranih eritrocita (eritrociti + 1% rastvor normalnog zečjeg seruma);

2) potpunost deplecije hemaglutinina u svakom test serumu (test serum u najnižem razblaženju + formalinizovani eritrociti);

3) ispravnost određivanja minimalne neutralizujuće doze antigena (2, 1 i 0,5 neutralizujuća doza antigena + antitelo eritrocitni dijagnostikum).

Reakcija reverzne indirektne hemaglutinacije (ronga) koristi se za indikaciju bakterijskih i virusnih antigena u test materijalima, kao i za brzu dijagnozu brojnih infekcija.

Za razliku od RNGA, u ovoj reakciji crvena krvna zrnca nisu senzibilizirana antigenom, već antitijelima, čija se aglutinacija događa kada se doda antigen.

Crvena krvna zrnca su prethodno fiksirana formaldehidom ili glutaraldehidom, a zatim vezana za gama globulin, koji je izoliran iz imunoloških seruma i pročišćen od drugih proteina u serumu. Vezivanje gama globulina na površinu crvenih krvnih zrnaca odvija se uz pomoć krom hlorida. Da biste to učinili, dodajte 1 zapreminu imunoglobulina izolovanih iz imunološkog seruma, 1 zapreminu 50% suspenzije formalinizovanih eritrocita i 1 zapreminu 0,1-0,2% rastvora hrom-hlorida u 8 zapremina destilovane vode. Smjesa se ostavi 10-15 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim se crvena krvna zrnca tretiraju kao u reakciji pasivne hemaglutinacije.

Specifičnost dijagnostikuma antitijela provjerava se u reakciji inhibicije pasivne hemaglutinacije homolognim antigenom. Reakcija mora biti inhibirana homolognim antigenom najmanje 16 puta, a ne inhibirana heterolognim. Kontrola se koristi kako bi se osiguralo odsustvo spontane hemaglutinacije.

Koristeći ovu reakciju, patogeni se indiciraju u materijalu uzetom iz organa mrtvih ljudi i životinja, na primjer, iz mozga, slezene i jetre pluća. Pripremite 10% suspenziju ovih organa u izotoničnom rastvoru natrijum hlorida, centrifugirajte ih 30-60 minuta na 10.000 o/min i koristite supernatant kao antigen.

Metodologija. Pripremite 2-struka razrjeđenja test materijala (antigena) u otopini za stabilizaciju. Dodajte 1 kap svakog razblaženja antigena u 3 susedna ležišta mikropanela (reakcija zauzima 3 paralelna reda jažica). Dodajte 1 kap stabilizirajućeg rastvora u svaku jažicu prvog reda, 1 kap homolognog imunog seruma razblaženog 1:10 u jažice drugog reda, 1 kap heterolognog imunog seruma u trećem redu. Drugi i treći red služe kao kontrole za specifičnost reakcije. Smjesa se ostavi 20 minuta na sobnoj temperaturi.

Dodajte 1 kap 1% suspenzije senzibiliziranih eritrocita (dijagnostikum eritrocitnih antitijela) u sve jažice i dobro protresite ploče. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir nakon 30-40 minuta. U prisustvu specifičnog antigena, hemaglutinacija je uočena u prvom i trećem redu (sa heterolognim serumom), a izostaje u drugom redu, gdje je antigen prethodno neutraliziran homolognim serumom.

Reakcija je praćena kontrolama senzibiliziranih eritrocita za spontanu aglutinaciju.

Reakcija inhibicije indirektne hemaglutinacije (RTONGA) omogućava vam da odredite prisutnost antitijela u serumu ljudi i životinja.

Metodologija. Serumi se razrijede 10 puta izotoničnom otopinom natrijum hlorida, zagrijavaju 20 minuta na temperaturi od 65°C da se unište nespecifični inhibitori, a zatim se pripremaju 2-struka razrjeđenja seruma u stabilizirajućoj otopini i radnoj dozi. antigen koji sadrži 4 aglutinirajuće jedinice. Dodajte 1 kap svakog razrjeđenja seruma u jažice mikropanela i dodajte im 1 kap antigena, čije razrjeđivanje odgovara radnoj dozi. Nakon kontakta sa komponentama smeše tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, dodajte 1 kap dijagnostikuma eritrocitnih antitela u sve jažice i dobro protresite. Nakon 1,5-2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, rezultati reakcije se uzimaju u obzir za hemaglutinaciju. Titar seruma je njegovo najveće razrjeđenje, koje potpuno inhibira reakciju hemaglutinacije s četiri aglutinirajuće antigenske jedinice.

Reakcija je praćena kontrolama senzibiliziranih eritrocita za spontanu aglutinaciju u prisustvu: a) stabilizirajuće otopine; b) normalan antigen (iz materijala koji ne sadrži virus); c) test serum. Prednost reakcije je njena svestranost i sposobnost da se koristi za otkrivanje različitih antigena.

Procjena rezultata hemaglutinacije. Rezultati RNGA, RONGA i RTONGA se uzimaju u obzir prema stepenu aglutinacije eritrocita: (++++) – potpuna aglutinacija; (+++) – manje potpuna aglutinacija; (++) – djelomična aglutinacija; (+) – tragovi aglutinacije; (–) – odsustvo aglutinacije.

Reakcija se smatra pozitivnom ako je aglutinacija potpuna (++++) ili skoro potpuna (+++), dijagnostikum ne daje spontanu aglutinaciju u prisustvu svake komponente reakcije, a kontrola specifičnosti antigen ili antitijelo je pozitivno.