Süüfilise diagnoosimiseks kasutatakse reaktsiooni. Kaasaegsed meetodid süüfilise diagnoosimiseks

Väljaande leheküljenumbrid: 34-39

A.Yu.Mironov, Yu.B.Terehova

MMA im. I.M.Sechenova

Süüfilise laboratoorne diagnoos
Süüfilis on väga mitmekesine, seda iseloomustab rikkalik manifest- ja varjatud vormide palett, polüsündroomsed kahjustused, mille äratundmine põhineb patsiendi terviklikul kliinilisel ja laboratoorsel uuringul.
Süüfilisega patsientide uurimistöö materjaliks on veri, šankreeritus ja piirkondlike lümfisõlmede punkt. Uurimistöö materjali ja mikrobioloogilise diagnostika meetodi valiku määrab haiguse patogeneesi staadium.
Laboratoorsed diagnostikameetodid hõlmavad bakterioskoopilist (esialgsel etapil) ja seroloogilist meetodit. Bakterioloogilisi uuringuid tavaliselt ei tehta, kuna olemasolevaid meetodeid patogeeni puhaskultuuri eraldamiseks ei ole välja töötatud.
Tulenevalt asjaolust, et süüfilise tekitaja on Treponema pallidum- erinevalt teistest mikroorganismidest kasvatatakse seda in vitro toitainekeskkonnas halvasti ja võtab halvasti vastu ka aniliinvärve; kõik olemasolevad selle tuvastamise meetodid võib jagada otsesteks ja kaudseteks.
Otsesed testid põhineb patogeenide otsesel tuvastamisel kahjustustes. Nende hulka kuuluvad: tumevälja mikroskoopia ja RIT (jänese infektsioossuse test) - nakatumine haigete küülikute materjaliga. Kaudsed testid põhineb süüfilise tekitaja antikehade tuvastamisel vereseerumis. Need on seroloogilised diagnostikad, samuti harva kasutatavad histoloogilised uuringud.
Kõik praegu olemasolevad süüfilise seroloogilised testid on jagatud kahte põhirühma:
. mittetreponemaalne [komplemendi fikseerimise reaktsioon kardiolipiin-Ag-ga (CRCA), mikrosadestamisreaktsioon (RMR), Plasma Reaginsi kiire test (RPR), Veneral Disease Research Laboratory (VDRL), Toluidin Red kuumutamata seerumi test (TRUST)];
. treponemaalne[komplemendi sidumise reaktsioon treponemaalse Ag-ga (RSKt), kahvatu treponema immobilisatsioonireaktsioon (RIBT või RIT), immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) (välismaal - FTA - fluorestseeruv Treponema l anibody) valikutega: RIF-200 (FTA-200), RIF-abs (FTA-abs), passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon (RPHA) - välismaal - Treponema pafluidum hemaglutination assay (TPHA), ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) - välismaal - Enzymelynked immunosorbent assay (ELISA), immunoblotanalüüs (Western Blot)].
Otse treponeemide visualiseerimine tumevälja mikroskoopia abil on veenev tõend haiguse treponemaalse olemuse kohta. See meetod on kõige tõhusam primaarse ja sekundaarse süüfilise, naha ja limaskestade kahjustuste korral. Kui mikroskoopia on vaja eristada T. pallidum, alamliik pallidum, fibriinniitidega, aga ka inimkeha normaalse mikrofloora treponeemidega - T. refringens ja T. denticola. T. refringens koloniseerib välissuguelundite limaskestad ja seda iseloomustab väljendunud liikuvus ja painutusliigutuste puudumine. T. denticola koloniseerib suu limaskesta, selle pöörised on lühemad ja suunatud teravama nurga alla.
Tumevälja mikroskoopia tundlikkus on 74-86% ja spetsiifilisus kuni 97%, olenevalt uurija oskustest. Tundlikkus võib väheneda, kui kahjustus on antiseptikumiga pühitud. Erinevatest teguritest tulenev negatiivne tulemus ei ole aga aluseks süüfilise diagnoosi välistamisele ja nõuab täiendavat kinnitust seroloogiliste diagnostikameetoditega. Lisaks on selle meetodi abil võimatu jälgida nakkusprotsessi dünaamikat ja hinnata ravi efektiivsust.
Otsene test T. pallidum fluorestseeruvate antikehadega (DFA-TP) kasutab fluorestseiiniga konjugeeritud antikehi, et värvida keha määrdudes ja koelõikudes. DFA-TP ei vaja liikuvaid organisme ning on tundlikum ja spetsiifilisem, kuid kallim ja tehniliselt keerulisem kui tumevälja mikroskoopia. Mõlema mikroskoopilise tehnika tundlikkust võivad negatiivselt mõjutada vigastuse vanus või seisund, samuti see, kas patsient on saanud ravi. Mitmete välisautorite sõnul otsesed määramismeetodid T. pallidum Nende hulka kuuluvad nukleiinhapete amplifikatsioonil põhinevad meetodid, nagu PCR, mis suudab tuvastada vaid 10 treponeemi olemasolu kahjustustes, platsenta kudedes ja muudes kehakudedes. Need on oluliselt parandanud otsetuvastusmeetodite tundlikkust ja spetsiifilisust. Mitmekordne PCR samaaegse tuvastamisega T. pallidum, 2. tüüpi herpesviirust ja Haemophilis ducreyi kasutatakse etioloogilise diagnoosi tegemiseks GUD-ga (genitaalhaavandi haigus) patsientidel, samuti sündroomi ravi algoritmide põhjendamiseks. Kuna süüfilise PCR-meetodid pole kaubanduslikult saadaval, jäävad need teadlaste vahendiks. Bioloogilise diagnostika meetodit kasutatakse vaatamata selle kõrgele tundlikkusele tulemuste saamiseks kuluva aja pikkuse ja kõrgete kulude tõttu väga vähe. Praegu seda praktiliselt ei kasutata. Tänapäeval on süüfilise laboratoorses diagnoosimises juhtiv roll seroloogilistel uurimismeetoditel (Vene Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi 26. märtsi 2001. aasta korraldus nr 87 "Süüfilise seroloogilise diagnoosimise parandamise kohta"), alates sellest ajast. T. pallidum tekitab erinevat tüüpi immuunvastuseid (joonis 2).
Mittetreponemaalsetes testides kasutatakse mittetreponemaalse päritoluga antigeeni (tavaliselt kardiolipiini-letsitiini-kolesterooli antigeeni). Treponeemide pinnal olevad fosfolipiid-Ag-i vastased antikehad ristreageerivad imetajate kardiolipiin-Ag-idega. Flokulatsioonimeetodid nende fosfolipiidantikehade tuvastamiseks on välja töötatud mittespetsiifiliste skriiningtestidena. Nende hulka kuuluvad RMP ja selle modifikatsioonid: RPR-, VDRL-, TRUST-test. Need testid tuvastavad rakuseina lipiidide vastaseid IgG ja IgM antikehi T. pallidum, mis ilmuvad veres ligikaudu 1 nädal pärast šankroidi moodustumist. Need testid on lihtsad, kiired, odavad ja suurepärase tundlikkusega, eriti nakkuse varases staadiumis. Peamisteks puudusteks on võimetus kasutada täisverd, vajadus rotaatori või mikroskoobi järele ning võimalus saada valepositiivseid tulemusi. Rasedate naiste puhul võivad kuni 28% positiivsetest RPR-i tulemustest olla bioloogilised valepositiivsed. Valenegatiivsed tulemused võivad ilmneda liigse AT korral, mida tuntakse prosooni nähtusena. Ristreaktsiooni võib esineda teiste treponemaalsete infektsioonide, sealhulgas lengerdus- ja lengerdusinfektsioonidega.
Mittereponemaalsed testid võivad olla kvalitatiivsed või poolkvantitatiivsed. RPR ja VDRL tiitrid tõusevad patsientidel, kellel on äge infektsioon, uuesti nakatumine või vana infektsiooni taasaktiveerimine, mida ei ole rahuldavalt ravitud. Umbes 72–84% primaarse või sekundaarse süüfilisega patsientidest väheneb 6 kuud pärast õige ravi lõppu RPR ja VDRL tiitrid 4 korda. Seroreversiooni määr sõltub ravieelsest tiitrist ja haiguse staadiumist. Inimestel, kellel on esimene nakkusepisood, on seroreversiooni tõenäosus suurem kui korduva infektsiooniga inimestel. Seetõttu ei kasutata mittetreponemaalseid teste mitte ainult aktiivse infektsiooni kindlakstegemiseks, vaid ka ravi efektiivsuse jälgimiseks (vt joonis 2).
Treponemaalseid teste, nagu RSKt, RIBT või RIT, RIF (välismaal - FTA ja FTA-ABS), RPHA (TPHA või TPPA), kasutatakse positiivsete skriiningtestide kinnitamiseks, mittetreponemaalsete testide valepositiivsete tulemuste tuvastamiseks, kui süüfilise kliinilise, epidemioloogilise ja anamnestilise kahtluse korral, haiguse varjatud vormide diagnoosimiseks, patsiendi retrospektiivse diagnoosi seadmiseks. Treponemaalsetes testides kasutatakse treponemaalse päritoluga antigeene.
RIT ja RIF on kõrgema tundlikkusega (74-94 ja 84-99%) ja spetsiifilisusega (vastavalt 99 ja 97%) ning neid kasutatakse selektsioonireaktsioonide tulemuste kinnitamiseks, RMP ja RSC valepositiivsete tulemuste äratundmiseks, samuti määrata süüfilise retrospektiivne diagnoos. Nende meetodite miinusteks on tehniline keerukus, protseduuri kestus, subjektiivsus tulemuste hindamisel, uuringu kõrge hind ja vajadus kõrgelt kvalifitseeritud töötajate järele. Arvestada tuleb ka sellega, et mitmete autorite sõnul püsivad ligikaudu 85%-l adekvaatselt ravitud patsientidest treponemaalsed testid positiivsed mitu aastat ja isegi kogu elu jooksul ning seetõttu ei saa neid kasutada ravi kontrollina. Treponemaalsed testid on kallid, nõuavad seadmeid ja tehnilist väljaõpet ning on saadaval ainult kesklaborites.
Immunoblotimist on pakutud FTA-ABS-i alternatiivina kinnitava testina. See on tundlikum kui FTA-ABS, kuid vähem tundlik kui TPPA. Valepositiivsete testide määr on veidi madalam treponemaalsetes testides kui mittetreponemaalsetes testides. Treponemaalseid teste tavaliselt sõeluuringuks ei kasutata, kuna need ei ole primaarse süüfilise esimese 2–3 nädala jooksul nii tundlikud kui mittetreponemaalsed testid. TreponemalTreponemaalsed kõhulihased püsivad sageli kogu elu jooksul, mistõttu need testid ei ole nii kasulikud kinnitavate testidena piirkondades, kus haigus on kõrge; need ei sobi ka ravi efektiivsuse jälgimiseks.
Viimastel aastatel on süüfilise laboratoorse diagnoosimise kodumaisesse praktikasse kasutusele võetud standardiseeritud väga informatiivsed serodiagnostika meetodid - ELISA ja RPGA. ELISA põhimõte on ühendada AG-AT kompleks konjugaadiga, mis sisaldab substraadisegust tuvastatud ensüümi märgist. RPGA-d kasutatakse spetsiifiliste antikehade tuvastamiseks T. pallidum vereseerumis: AG kombinatsiooniga T. pallidum spetsiifiliste antikehadega reaktsioonis mikroplaadil täheldatakse erütrotsüütide aglutinatsiooni nähtust. Nende meetodite eelised seisnevad selles, et ELISA ja RPGA testimissüsteemid on sertifitseeritud ja vastavate organisatsioonide poolt regulaarselt jälgitud. Seadistuse lihtsuse, automaatse salvestamise võimaluse ja tulemuste saamise kiiruse tõttu suure hulga proovide uurimisel saab ELISA-d ja RPGA-d kasutada nii sõel- kui ka kinnitavate reaktsioonidena, kuna need on tundlikkuse, spetsiifilisuse ja reprodutseeritavuse poolest paremad. CSR-ile ega jää alla RIT-ile ja RIF-ile. Kuid tuleb märkida, et ELISA, nagu ka teised süüfilise reaktsioonid, võib anda nii valepositiivseid kui ka valenegatiivseid tulemusi. Esimene võib tekkida reumatoidfaktori, milleks on inimese IgG, tõttu antikehad, mis ristreageerivad treponemaalsete antigeenidega, moodustuvad mitmesuguste süsteemsete haiguste korral või on põhjustatud ravimitest, ravimitest, ainevahetushäiretest; vastsündinutel - IgM-AT moodustumise kaudu loote või lapse kehas ema IgG-ks, mis raskendab oluliselt tulemuste tõlgendamist ja kaasasündinud süüfilise diagnoosimist. Valenegatiivsed reaktsioonitulemused on koos tehniliste vigadega tingitud konkurentsist IgM ja IgG vahel, kuna viimasel on suurem afiinsus. RPGA negatiivne külg on see, et seda testi ei saa kasutada haiguse ravimise kriteeriumina, kuna selliste reaktsioonide eitamine on tavaliselt keeruline, pealegi võivad need jääda positiivseks kogu elu jooksul.
Kahjuks põhinevad kõik süüfilise seroloogilise diagnoosimise meetodid T. pallidum'i esinemise kaudsel indikaatoril - AT vastusel Treponema pallidumile patsientide veres. See on viinud tõsiasjani, et seni ei ole üheselt seletust seroloogilise resistentsuse tekkepõhjuse ja sama tüüpi ravi saanud patsientide negatiivsuse ajastuse erinevustele, tekivad probleemid kaasasündinud süüfilise usaldusväärse diagnoosi seadmisel ja kriteeriumid. süüfilise patogeeni elujõulisuse määramiseks peremeesorganismis ei ole välja töötatud.
Süüfilise serodiagnostika puudujäägid andsid tõuke viimastel aastatel laialt levinud süüfilise diagnoosimise molekulaargeneetiliste meetodite väljatöötamiseks. Patenteeritud süüfilise PCR-diagnostika meetodid (meetod spetsiifiliste DNA järjestuste määramiseks T. pallidum mis koosneb DNA amplifikatsioonist). Vaatamata PCR-diagnostika mitmetele eelistele on neil meetoditel ka olulisi puudusi, mille hulgas tuleb märkida nende kõrget hinda, mis on tingitud PCR-diagnostika praimerite kõrgest maksumusest ja laboriseadmete kõrgest maksumusest, mis piirab nende meetodite kasutamine laboripraktikas.
Sellega seoses on kaasaegsete odavate, väga tundlike ja spetsiifiliste meetodite väljatöötamine süüfilise laboratoorseks diagnoosimiseks asjakohane ja väga oluline arstiteaduse ja praktilise tervishoiu jaoks.
Praegu töötatakse välja uusi diagnostikameetodeid, mis põhinevad süüfilise elundikahjustuse molekulaarsete markerite tuvastamisel gaasikromatograafia ja massispektromeetria (GC-MS) abil. GC-MS meetodite lisamine süüfilise laboridiagnostika arsenali võimaldab kindlaks teha süüfilise esinemise. T. pallidum organismis spetsiifilise molekulaarse markeri olemasolu tõttu. Nende uuringute kohaselt näidati, et süüfilisega patsientide vereseerumi biokeemiline koostis erineb tervete doonorite seerumist. Süüfilisega patsientide vereseerum sisaldab lipiide, süsivesikuid ja aminohappeid, mis võivad toimida molekulaarsete markeritena. T. pallidum kehas (K.A. Osman, 2004). Samuti tuvastati GC-MS meetodil keemilised ühendid, mis on haiguse varases staadiumis elundikahjustuse molekulaarsed markerid. Vastavalt uuringutele K.A. Osman (2004), sellisteks ühenditeks kesknärvisüsteemi kahjustuse korral on D-galaktoos, D-trentool, glükoos ja selle tsükliline isomeer - inositool, maksakahjustuse korral - rasvhapete aromaatsed derivaadid (fenüülpropioon- ja fenüüläädikhape) , aminohappefragmendid, lipiid-valgu kompleks, luukahjustuse korral - lenduvad rasvhapped, lipopolüsahhariidid ja nende subühikud (C18-C20). Seega võimaldab gaasikromatograafia ja massispektromeetria meetodite kasutamine diagnostikaarsenalis suure usaldusväärsusega kindlaks teha elundite ja süsteemide kahjustuste olemasolu positiivsete seroloogiliste reaktsioonide ja haiguse väljendunud kliiniliste ilmingute puudumisel.

Reagini teste kasutatakse patsientide massiliseks süüfilise sõeluuringuks. Tavaliselt viiakse need läbi ennetava läbivaatuse osana. Sellised uuringud on saadaval igas meditsiiniasutuses ja tehakse kiiresti. Vastus on tavaliselt valmis 30-40 minuti pärast.

Positiivne tulemus reagin-reaktsioonide ajal ei ole diagnoosi tegemise kriteerium. Vaja on täiendavaid liigispetsiifilisi uuringuid.

Kõige tavalisem sõelumismeetod on Wassermani reaktsioon. See kasutab kardiolipiini ja treponemaalseid antigeene. Kui vereseerumis reagiine pole, siis toimub lamba punaste vereliblede hemolüüs, mis lisatakse indikaatorina.

Reagiinide juuresolekul sadestuvad terved punased verelibled, sel juhul loetakse reaktsioon positiivseks.

Reageerige järgmistel juhtudel:

• muud haigused, mille tekitajad on antigeense struktuuri poolest sarnased kahvatu spiroheediga
• Rasedus
• onkoloogilised haigused
• salitsülaatide võtmine
• müokardiinfarkt
• tehnilised vead analüüsi käigus

Kui reagiini reaktsioon on positiivne, tehakse spetsiifilised seroloogilised testid. Need on ette nähtud ka negatiivse tulemuse kahtluse korral.

Treponemaalseid antigeene kasutatakse sellistes testides nagu RIF, RIT, ELISA, RPGA, hemadsorptsioonireaktsioon tahkes faasis. Need reaktsioonid põhinevad antigeen-antikeha komplekside moodustumisel ja erinevad nende määramismeetodi poolest. Kõige sagedamini kasutatakse immunofluorestsentsreaktsiooni.

Ravimit töödeldakse luminestseeruva seerumiga, mis võimaldab luminestsentsmikroskoobi all määrata immuunkomplekse.

Üks tundlikumaid seroloogilisi reaktsioone süüfilise diagnoosimisel on RPHA. Meetod on väga täpne. Seda kasutatakse sageli diagnoosi kinnitamiseks raseduse ajal, kui teised testid võivad anda valepositiivse tulemuse.

Serodiagnoosi tunnused

Sest süüfilise seroloogiline diagnoos selle erinevatel perioodidel verd võetakse veenist. Analüüs on soovitatav teha tühja kõhuga, see vähendab valepositiivsete tulemuste arvu. Katseklaas peab olema steriilne. Ekspresstestide tegemisel võetakse mõnel juhul verd sõrmest.

Kahtluse korral võetakse serodiagnoosimiseks tserebrospinaalvedelikku. Selle analüüsimiseks kasutatakse samu meetodeid, mis vereanalüüside puhul.

Süüfilise diagnoosimiseks läbige meie kliinikus täielik läbivaatus.

Süüfilis on spiroheedi Treponema pallidum põhjustatud nakkushaigus, mis on kalduvus progresseeruvale kroonilisele kulgemisele ja millel on selge kliiniliste sümptomite perioodilisus.

Seksuaalse leviku ülekaal kontakti ja transplatsentaarse ülekandumise ees asetab selle haiguse sugulisel teel levivate haiguste (STD-d, STI-d) hulka. Lisaks nendele nakkuse leviku meetoditele mängib erilist rolli kunstlik tee (ladina keelest "artificio" - kunstlikult loodud).

See on tüüpiline meditsiiniasutustele, peamiselt haiglatingimustes. Nakatumine toimub vereülekannete, erinevate kirurgiliste operatsioonide ja invasiivsete diagnostikameetodite ajal.

Hoolimata annetatud vere karantiinist on süüfilise tuvastamise probleem doonoritel haiguse erinevates staadiumides endiselt aktuaalne.

Seetõttu nõuavad süüfilise diagnostilised meetmed standardimist, uute tundlike ja informatiivsete identifitseerimismeetodite kasutuselevõttu, samuti vigade minimeerimist ja analüüsitulemuste ebaõiget tõlgendamist.

Näita kõike

1. Laboratoorsete diagnostikameetodite klassifikatsioon

Süüfilise diagnoosimisel on mõned tunnused ja see erineb teiste bakteriaalsete infektsioonide diagnoosimisest. Treponema pallidum'i keeruline struktuur ja antigeensed omadused põhjustavad seroloogiliste reaktsioonide tulemuste tõlgendamisel vigu.

On kolm peamist patsientide rühma, kellele pakutakse süüfilise vereanalüüsi:

1. 1 Rahvastikurühmade sõeluuring ja tervisekontroll (sealhulgas rasedus, sünnituseelses kliinikus registreerimine, töötamine ja haigusloo registreerimine jne).
2. 2 Sõeluuringud riskirühmades (kaitsmata seks süüfilisega nakatunud isikuga, inimesed pärast sunnitud seksuaalvahekorda, HIV-nakkusega inimesed jne).
3. 3 Haigusnähtudega isikud või süüfilise infektsiooni kahtlusega isikud.

Kõik laborimeetodid jagunevad tinglikult otsesteks ja kaudseteks.

1.1. Otsesed meetodid

1. 1 Treponema pallidum'i tuvastamine pimedas väljas (tumevälja mikroskoopia).
2. 2 Katseloomade nakatumine (kasvatamine laboriloomadel).
3. 3 PCR (polümeraasi ahelreaktsioon).
4. 4 DNA sond või nukleiinhappe hübridisatsioon.

1.2. Kaudsed meetodid

Seroloogilised reaktsioonid on laboratoorsed diagnostikameetodid, mis põhinevad Treponema pallidum'i antigeenide (lühendatult AG) antikehade (lühendatult AT) tuvastamisel. Need on diagnoosi kinnitamisel esmatähtsad.

1. 1 Mitte-treponemaalsed testid:
   • Wassermani reaktsioon (WRS);
   • mikrosadestamisreaktsioon (MR, RMP) ja selle analoogid, mis on toodud allpool;
   • Plasma kiirreagiini test (RPR, RPR);
   • Punase toluidiini seerumi test (TRUST);
   • Venereaalsete haiguste uurimislabori mittetreponemaalne test - VDRL.
2. 2 Treponemaalset testi:
   • Treponema pallidum'i immobiliseerimise meetod – RIBT/RIT;
   • Immunofluorestsentslahus - RIF, FTA (seerumi lahjendused RIF-10, RIF-200, RIF-abs);
   • Passiivse hemaglutinatsiooni R-sioon (RPGA, TRPGA, TPHA);
   • Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA, EIA);
   • Immunoblotanalüüs.



Joonis 1 – süüfilise serodiagnostika algoritm

1.3. Histomorfoloogilised meetodid

Need meetodid taanduvad süüfilise ilmingute histomorfoloogia tunnuste tuvastamisele. Tähelepanu pööratakse šankri ülesehituse peensustele. Nakkuse diferentsiaaldiagnostika histoloogia abil on aga väga raske. Histomorfoloogiat kasutatakse koos teiste laboratoorsete ja kliiniliste testidega.

2. Treponema pallidum'i tumevälja mikroskoopia

See meetod põhineb treponema pallidum'i otsesel tuvastamisel uuritavas materjalis mikroskoobi ja spetsiaalsete seadmete abil (enamasti erosioonidest ja haavanditest, harvemini tserebrospinaalvedelikust ja muudest substraatidest).

Skarifikatsiooni, kraapimise, pigistamise abil saadakse erosioonidest ja haavandilistest defektidest eksudaat, seejärel uuritakse valmistatud preparaati mikroskoobi all.

Tavaliselt tuvastatakse treponema pallidum preparaadis, mis on saadud šankrist, sekundaarse värske, sekundaarse korduva süüfilise fookustest, samuti lümfisõlmede ja platsenta punktidest.

Tuginedes väikeste osakeste nähtusele, mis valguskiire tabamisel pimedas väljas helendavad (Tyndalli fenomen), võimaldab see meetod suurepäraselt eristada süüfilise põhjustajat teistest treponeemidest, lähtudes morfoloogilistest erinevustest ja liikumisviiside erinevusest. bakter.

Mikroskoopia jaoks kasutatakse spetsiaalset sobiva optilise eraldusvõimega tumevälja kondensaatorit. Ravim saadakse purustatud tilga meetodil (tilk materjali kantakse puhtale rasvavabale klaasklaasile ja kaetakse väga õhukese katteklaasiga).

Sukeldusõli tilgutatakse katteklaasile. Toru keerates ja suurendusläätse keerates reguleeritakse soovitud valgustust.

Mikroskoobi pimedas väljas tuvastatakse vererakud, epiteelirakud ja süüfilise tekitaja. Treponema pallidum näeb välja nagu spiraal, väga õhuke, kiirgab hõbedast värvi, sujuvate liigutustega.



Joonis 2 – Tumevälja mikroskoopia kui viis Treponema pallidum’i visualiseerimiseks uuritavas materjalis. Illustratsiooni allikas - CDC

Treponema pallidum tuleb eristada teistest treponeemidest, sealhulgas Tr. refringens, mida võib leida orofarünksis ja suguelundite limaskestal. See bakter teeb kaootilisi liigutusi, tal on laiad ja asümmeetrilised, üsna karedad lokid. Lisaks eristatakse Treponema pallidum Tr. Microdentium, Tr. Buccalis ja Tr. vincenti.

Bakterite visualiseerimist pimedas väljas täiendab mõnikord fluorestsentsreaktsioon. Sel eesmärgil lisatakse natiivsele materjalile fluorestseeruva värvainega märgistatud antitreponemaalsed antikehad. Sel juhul moodustub kompleks nimega antigeen-antikeha (lühendatult AG-AT), mida uuritakse fluorestsentsmikroskoobiga.

3. Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetod

PCR, mis töötati välja 1991. aastal Treponema pallidum'i desoksüribonukleiinhappe (DNA) molekuli tuvastamiseks, on väga tundlik ja spetsiifiline, võimaldades tuvastada patogeeni DNA fragmente.

See analüüs põhineb DNA lühikeste lõikude kopeerimisel kahvatust spiroheedist, mis vastab määratud parameetritele ja on proovis. Kõik see toimub kunstlikes tingimustes (in vitro). Reaktsioon viiakse läbi seadmes - termotsükleris, mis tagab temperatuuritsüklite periodiseerimise. Jahutamisele järgneb katseklaaside kuumutamine veaga 0,1˚C.

DNA matriitsi kuumutatakse 2 minutit temperatuuril 92–98 ˚C (kui polümeraas on termostabiilne, kasutatakse maksimaalset temperatuuri). Kuumutamisel eralduvad DNA ahelad nendevaheliste vesiniksidemete lagunemise tõttu. Anniilimisetapis alandatakse reaktsiooni temperatuuri, et siduda praimer üheahelalise matriitsiga.

Lõõmutamine võtab aega umbes 30 sekundit ja selle aja jooksul sünteesitakse sadu nukleotiide. Äsja sünteesitud molekulid kopeeritakse polümeraasi abil, mille tulemusena paljunevad spetsiifilised desoksüribonukleiinhappe fragmendid. Fragmentide järgnev tuvastamine viiakse läbi agargeelelektroforeesi abil.

Süüfilise PCR-diagnoos on oma olemuselt veel eksperimentaalne, kuid õigustatud kaasasündinud infektsiooni tuvastamisel, keeruliste diagnostiliste juhtumite korral või kui Treponema pallidum'i sisaldus on uuritavas materjalis minimaalne.

4. DNA hübridisatsioon

DNA hübridisatsioon viiakse läbi in vitro ja see põhineb kahe üheahelalise DNA molekuli täielikul või osalisel ühendamisel üheks molekuliks. Komplementaarsete fragmentide täieliku vastavuse korral toimub ühinemine kergesti. Kui komplementaarne sobivus on osaline, toimub DNA ahelate liitumine aeglaselt. Ahela sulandumise aja põhjal saab hinnata komplementaarsuse astet.

Kui DNA-d kuumutatakse puhverlahuses, lõhuvad vesiniksidemed komplementaarsete lämmastikualuste toimel, mis põhjustab DNA ahelate lahknemise. Järgmisena saadakse ravim kahest denatureeritud desoksüribonukleiinhappest. Jahutamisel renatureeritakse üheahelalised piirkonnad. Tekib nn DNA hübriid.

Meetod võimaldab hinnata ja analüüsida anniilimiskiirust, võttes arvesse DNA tunnuseid (sarnasusi ja erinevusi) liikide vahel või liigisiseselt.

DNA-sondi kasutamine hõlmab märgistatud DNA fragmendi hübridiseerimist spetsiifilise DNA piirkonnaga, et tuvastada komplementaarsed nukleotiidjärjestused. Sondi märgistamiseks kasutatakse rühma küllastumata aatomeid (kromofoore) või radioaktiivseid isotoope.

DNA-sondi kasutatakse nukleiinhapete heterogeenseks ja homogeenseks tuvastamiseks. Sondi ülesanne on tuvastada piirkonnad, kus sihtmärk-sond on sulandunud. Homogeenses süsteemis tuvastamise eeliseks on see, et see võimaldab jälgida DNA molekulide hübridisatsiooni reaalajas.

Meetodi olemus on DNA denatureerimine ja renatureerimine (DNA ahelate taasühendamine). Nukleiinhappe ja DNA sondi renaturatsiooniprotsess lõpeb "hübriidi" moodustumisega.

Spetsiifilised nukleiinhappejärjestused hübridiseeruvad DNA sondiga ja tuvastatakse seega ning võimaldavad hinnata DNA kogust uuritavas materjalis.

5. Laboriloomade nakatumine

Küülikute kõrge tundlikkus Treponema pallidumi suhtes (umbes 99,9%) võimaldab neid kasutada süüfilise infektsiooni diagnoosimisel.

Küülikute nakatamine toimub uurimiskeskustes ja see on "kuldstandard" muude meetodite tundlikkuse hindamisel.

Pöördume tagasi treponemaalsete ja mittetreponemaalsete testide juurde, kuna neid kasutatakse kõige sagedamini. Vaatleme nende eeliseid ja puudusi, samuti vigu tulemuste tõlgendamisel.

6. Mittetreponemaalsed testid

Need on testid IgG ja IgM antikehade määramiseks standardiseeritud kardiolipiini antigeeni suhtes. Nende oluline puudus on suhteliselt madal spetsiifilisus.

Madal hind ja teostamise lihtsus võimaldavad neid teste klassifitseerida diagnostilisteks testideks, mis on vajalikud eeldiagnoosi seadmiseks ja elanikkonna sõeluuringuks.

Just mittetreponemaalseid analüüse tehakse haigusloo taotlemisel, tööle kandideerimisel või sünnituseelsesse kliinikusse registreerumisel.

Puudused:

1. 1 Minimaalne tundlikkus esmase süüfilise staadiumis – 70%;
2. 2 Minimaalne tundlikkus hilise süüfilise staadiumis – 30%;
3. 3 Valenegatiivsete ja valepositiivsete tulemuste võimalus;
4. 4 RSK täitmise töömahukus.

Eelised:

1. 1 Suhteliselt madalad katsetootmise kulud;
2. 2 Saate kiire vastuse;
3. 3 Nende kasutamise võimalus sõeluuringuks.

Valepositiivsete või nõrgalt positiivsete proovide saamine on võimalik järgmistel juhtudel:

1. 1 Täitmistehnoloogia rikkumine AG-AT kompleksi blokeerimisel.
2. 2 Patsiendil on autoimmuunhaigused (reumatoidartriit, reuma, sklerodermia, süsteemne erütematoosluupus, sarkoidoos jne).
3. 3 Pahaloomulised kasvajad.
4. 4 Viiruslikud ja bakteriaalsed infektsioonid.
5. 5 Endokriinsed haigused (autoimmuunne türeoidiit, suhkurtõbi).
6. 6 Rasedus.
7. 7 Alkoholi joomine.
8. 8 Rasvaste toitude söömine.
9. 9 Seniilne vanus.

Nagu loendist näete, on vale tulemuse jaoks palju põhjuseid. Seetõttu tuleks selle suhtes olla väga ettevaatlik. Vaatame koos RSC-ga veel kahte näidist. See on mikrosadestamise reaktsioon ja VDLR (selle modifikatsioon).

7. Komplemendi fikseerimise reaktsioon (RSK, Wasserman, RW)

See on test, mis põhineb komplemendi võimel seonduda AG-AT kompleksidega. Moodustunud kompleks tuvastatakse hemolüütilise süsteemi abil. Kardiolipiini antigeen suurendab oluliselt testi tundlikkust.

Tundlik on ka Kolmeri reaktsioon, mis seisneb selle läbiviimises erinevatel temperatuuritingimustel. Seega toimub Kolmeri reaktsiooni esimene faas temperatuuril 20˚C pool tundi, teine ​​faas temperatuuril 4-8˚C 20 tundi. Selle aja jooksul toimub komplemendi sidumine.

RSC läbiviimisel on võimalik saavutada dramaatiliselt positiivseid tulemusi. Tõenäoliselt on põhjuseks antikehade kõrge tiiter lahjendamata seerumis. Sel juhul antakse proove vähenevate annustega.

Süüfilise staadiumite eristamiseks ja süüfilisevastase ravi efektiivsuse hindamiseks määratakse AT kogus seerumis.

Proovi positiivsust hinnatakse ristide abil ning seerumi lahjendus on näidatud ka Wassermani, Kolmeri ja Kanni reaktsioonides.

8. Mikrosadestamise reaktsioon

Kuna ülaltoodud testide teostamise keerukus on suur, on erinevate populatsioonirühmade kliinilise läbivaatuse laiaulatuslikuks katmiseks välja töötatud süüfilise serodiagnostika kiirendatud meetod, nn ekspressmeetod - mikrosadestamisreaktsioon (lühendatult MR, RMP). .

Seda tehakse kardiolipiini antigeeni ja abiainetega. Selle eeliseks on perifeerse vere kogumine uurimistööks. See kiirendab oluliselt nii tehnikat ennast kui ka laborantide tööd.



Joonis 2 – mikrosadestamise reaktsioon (skeem)

MR tegemiseks on vaja patsiendi vere plasmat või inaktiveeritud seerumit (need sisaldavad antikehi). Järgmisena asetatakse plasma märgistatud süvenditesse. Seejärel lisatakse uuritavale materjalile tilk kardiolipiini antigeeni, segatakse ja loksutatakse. Selle tulemusena ilmuvad nakatunud inimese seerumis erineva intensiivsusega iseloomulikud helbed.

See on kvaliteetnäidis. Kvantitatiivseks hindamiseks kasutatakse 10 lahjendust seerumit, mis asetatakse 10 süvendisse, millel on sobiv märgistus. Kvalitatiivse MR puhul näidatakse vastust ristide (plusside) või miinusena; kvantitatiivse MR puhul näidatakse antikeha tiiter (1:2, 1:4 jne).

Helveste olemasolu loetakse positiivseks või nõrgalt positiivseks vastuseks. Flokulaadi ilmumine on võimalik ka haiguse puudumisel, seetõttu viiakse saadud tulemuse lõplik hindamine läbi pärast kontrolluuringut või muid reaktsioone (RIBT, RIF, ELISA, RPGA).

9. VDRL

Maailma Terviseorganisatsiooni soovitatud meetodit lipoidantigeeniga (AG) reaktsiooni määramiseks peetakse teiste standardsete mittetreponemaalsete testide seas õigustatult parimaks. Välja töötatud USA-s, Gruusias sugulisel teel levivate haiguste laboris (Venereal Diseases Research Laboratories).

Valimi nimeks oli asutuse lühend – VDRL. VDRL on MR-i modifikatsioon. Süüfilisega patsiendi seerum inaktiveeritakse ja asetatakse slaidile. Kasutatav antigeen koosneb erinevas protsendis kardiolipiinist, kolesteroolist ja letsitiinist. Vastus registreeritakse peaaegu kohe.

Antikehade olemasolul seerumis ilmneb selge flokulatsioon. Seerum muutub reaktiivseks pärast 4-nädalast nakatumist. Antikehade hulga hindamiseks lahjendatakse seerumit eksponentsiaalselt.

VDRL-i eelised:

1. 1 suhteliselt kõrge tundlikkus;
2. 2 suhteliselt kõrge spetsiifilisus;
3. 3 teostamise lihtsus;
4. 4 reaktiivide madal hind;
5. 5 kiire vastuse saamine.

VDRL-i puuduseks on suhteliselt kõrge valepositiivsete tulemuste määr.

Nende põhjused on samad eespool loetletud haigused.

Treponema testid tehakse spetsiifiliste Treponema pallidum antigeenidega. Need on lõpliku diagnoosi seadmiseks vajalikud ja kohustuslikud. Need on immunofluorestsentsreaktsioon (RIF), kaudne hemaglutinatsioonireaktsioon (IPHA), ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) jne.

Pärast mittetreponemaalse testi (RPR, MP, VDRL) positiivset tulemust tuleks alati teha treponemaalsed testid (tavaliselt kombinatsioon – RPHA, ELISA, RIF).

Treponemaalsed testid on keerulisemad kui kiirtestid ja nõuavad rohkem raha.

10. RIF

Seda reaktsiooni (lühendatult RIF) kasutatakse süüfilise, sealhulgas varjatud vormide diagnoosimiseks ning positiivsete ja valepositiivsete proovide kahekordseks kontrollimiseks.

RIF põhineb märgistatud antikehade säral, kui need on kombineeritud antigeeni-antikeha kompleksiga kvartslambi all. Meetodit hakati kasutama 60ndatel ja seda eristas selle rakendamise lihtsus ja kõrge spetsiifilisus (mis on veidi madalam kui RIBT).

Sellel on mitu modifikatsiooni: RIF-10, RIF-200 ja RIF-abs.

RIF on kõige tundlikum, kui seda lahjendada 10 korda, ülejäänud on spetsiifilisemad. RIF viiakse läbi kahes etapis. AG-le lisatakse patsiendi vereseerum. Moodustub AG-AT kompleks, mida uuritakse järgmises faasis. Järgmisena identifitseeritakse mikroskoopia abil fluorokroomiga märgistatud kompleks. Kui sära ei täheldata, näitab see spetsiifiliste antikehade puudumist vereseerumis.

RIF-200 on kõigist lahjendustest kõige väärtuslikum. Meetod on mõeldud süüfilise erinevate vormide, eriti latentse süüfilise diagnoosimiseks ja positiivsete proovide uuesti kontrollimiseks.

11. RIBT

Treponema pallidum'i (lühendatult RIBT, RIT) immobilisatsioonireaktsioon on üks keerukatest seroloogilistest testidest, mis nõuab märkimisväärseid jõupingutusi ja rahalisi kulutusi. RIBT-i kasutatakse üha vähem, kuid selle tähtsus latentse süüfilise diagnoosimisel säilib.

Sellel on suur tähtsus valepositiivsete tulemuste äratundmisel rasedatel ja see põhineb bakterite immobiliseerimisel immobilisiinide – hiliste antikehade – juuresolekul.

Tulemust hinnatakse immobiliseeritud treponeemide protsendi (%) alusel spetsiaalse tabeli abil:

1. 1 0 kuni 20 – test negatiivne.
2. 2 21 kuni 50 – nõrgalt positiivne test.
3. 3 50 kuni 100 - positiivne reaktsioon.

Valepositiivsed tulemused on võimalikud ka RIBT kasutamisel. Seega on vale vastus võimalik troopiliste trepanemataasidega nakatumise, samuti tuberkuloosi, maksatsirroosi, sarkoidoosi ja eakate patsientide puhul.

12. RPGA

Seda süüfilise vereanalüüsi nimetatakse passiivseks hemaglutinatsiooni testiks (lühendatult RPHA, THRHA vereanalüüs).

RPHA antigeen valmistatakse lamba punastest verelibledest, mis on kaetud Treponema pallidum'i fragmentidega (saadud nakatunud küülikutelt (vt joonis 4)). Analüüsiks kasutatakse patsiendi venoosset verd (plasma või inaktiveeritud seerum).

Kui süüfilisega patsiendi seerumile lisatakse antigeen, moodustub AG-AT kompleks, mis viib punaste vereliblede aglutinatsioonini. aglutinatsiooni määrab laboritehnik subjektiivselt.



Joonis 3 – RPHA skeem (passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon)

Proov hinnatakse positiivseks, kui ilmnevad ühtlase roosa värvusega aglutinaadid. Sademe punane värvumine näitab punaste vereliblede sadenemist. RPGA on väga tundlik ja väga spetsiifiline.

12.1. Mikrohemaglutinatsiooni reaktsioon

See on RPGA lihtsustatud versioon. Erineb ülalkirjeldatud testist selle poolest, et reaktsiooni läbiviimiseks on vaja vähem antigeeni, lahjendit ja seerumit. 4 tundi pärast seerumi inkubeerimist saab proovi hinnata. Kasutatakse süüfilise sõeluuringuks ja massiuuringuteks.

13. Ensüümi immuunanalüüs

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (lühendatult ELISA) põhineb spetsiifilisel antigeeni-antikeha reaktsioonil. Bioloogiline materjal (patsiendi vereseerum, tserebrospinaalvedelik) viiakse süvenditesse, mille tahkele pinnale on fikseeritud treponema pallidum antigeenid. Uuritavat materjali inkubeeritakse, seejärel pestakse ära antigeenidega seondunud antikehad (vt joonis 5).

Saadud kompleksi identifitseerimine viiakse läbi fermentatsioonifaasis, kasutades ensüümiga märgistatud immuunseerumit. Keemilise reaktsiooni käigus värvib ensüüm tekkivad kompleksid. Värvimise intensiivsus sõltub spetsiifiliste antikehade hulgast patsiendi veres ja see registreeritakse spektrofotomeetriga.



Joonis 4 – ELISA (ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs) skeem

ELISA tundlikkus on üle 95%. Meetodit kasutatakse automatiseeritud režiimis valikuliste elanikkonnarühmade: doonorite, rasedate ja teiste uurimiseks, positiivsete ja valepositiivsete mittetreponemaalsete testide diagnoosi selgitamiseks.

14. Immunoblotanalüüs

Immunoblotanalüüs on väga tundlik meetod, lihtsa ELISA modifikatsioon. Reaktsioon põhineb elektroforeesil Treponema pallidum'i antigeenide eraldamisega.

Eraldatud immunodeterminandid kantakse nitrotselluloospaberile ja arendatakse ELISA abil. Järgmisena inkubeeritakse seerumit ja seondumata antikehad pestakse maha. Saadud materjali töödeldakse ensüümiga märgistatud immunoglobuliinidega (IgM või IgG).

15. Süüfilise laboratoorse diagnoosimise tulemuste kliiniline hindamine

Allolevas tabelis 1 oleme esitanud võimalikud testitulemused ja nende tõlgendused. Nagu tabelist näha, on dešifreerimisel esmatähtis testide põhjalik hindamine.



Tabel 1 – seroloogiliste reaktsioonide (süüfilise vereanalüüsid) tulemuste tõlgendamine. Vaatamiseks klõpsake tabelil

Katse reaktsioonivõimet hinnatakse ka "ristide" abil:

1. 1 Maksimaalne vastus (järsult positiivne test) on tähistatud 4 ristiga.
2. 2 Positiivset testi tähistab 3 risti.
3. 3 Nõrgalt positiivset reaktsiooni tähistab kaks risti.
4. 4 Üks rist näitab kahtlast ja negatiivset tulemust.
5. 5 Eitav vastus on märgitud miinusmärgiga.

Süüfilise laboratoorse diagnostika optimeerimise probleem ei ole kaotanud oma tähtsust tänapäevani. Hoolimata teadlaste soovist viia diagnostika võimalikult kõrgele tundlikkuse ja spetsiifilisuse tasemele, nõuavad kaasaegsed diagnostikameetodid kontrollteste ja individuaalset lähenemist.

Süüfilise infektsiooni tunnuseks on seroresistentsuse nähtus, mis pole kunagi saanud teaduslikku selgitust. Diagnoos tehakse pärast patsiendi täielikku uurimist, kasutades epidemioloogilisi, kliinilisi ja laboratoorseid meetodeid.

Meditsiini majandusliku ja tehnilise arengu taustal on edusamme märgata ka süüfilise diagnoosimise uute kriteeriumide väljatöötamisel. Kõik see võimaldab teil patsiente kiiresti, edukalt ja täpselt ravida.

Primaarse süüfilise korral uuritakse kahvatu treponema pallidum'i suhtes šankroidset eritist või punkt-lümfisõlmi. Sekundaarse süüfilise korral võetakse materjal erodeerunud papulude pinnalt nahal, limaskestadelt, pragudelt jne. Enne materjali võtmist puhastatakse kahjustuste pind erinevatest saasteainetest (erosioonid, haavandid, praod). ) tuleb põhjalikult pühkida steriilse vati-marli tampooniga, mis on niisutatud naatriumkloriidi isotoonilise lahusega, või määrata sama lahusega losjoonid. Puhastatud pind kuivatatakse kuiva tampooniga ja plaatinasilmuse või spaatliga ärritatakse kergelt perifeerseid piirkondi, samal ajal surudes kummikinnas sõrmedega kergelt elemendi alust, kuni tekib koevedelik (seerum), millest valmistatakse ette uurimistöö ettevalmistus. Süüfilise diagnoosimisel on oluline koevedeliku saamine, kuna pallidreponema leidub lümfisüsteemi kapillaaride luumenis, lümfi- ja veresoonte ümber asuvates koepragudes.

Piirkondlike lümfisõlmede punktsioon

Lümfisõlmede kohal olevat nahka töödeldakse 96% alkoholi ja 3-5% alkoholi joodilahusega. Seejärel kasutage lümfisõlme fikseerimiseks vasaku käe 1. ja 2. sõrme. Parema käega võtke steriilne süstal mõne tilga isotoonilise naatriumkloriidi lahusega, mis süstitakse paralleelselt lümfisõlme pikiteljega. Nõel surutakse erinevates suundades sõlmekapsli vastasseinale ja süstla sisu süstitakse aeglaselt. Vasaku käe sõrmede abil masseeritakse kergelt lümfisõlme. Kui nõel tõmmatakse aeglaselt välja, tõmmatakse samal ajal välja süstla kolb, aspireerides lümfisõlme sisu. Materjal kantakse klaasklaasile (kui materjali kogus on väike, lisatakse tilk isotoonilist naatriumkloriidi lahust) ja kaetakse katteklaasiga. Loodusliku ravimi uurimine viiakse läbi pimedas vaateväljas, kasutades valgus-optilist mikroskoopi koos tumeda välja kondensaatoriga (40, 7x, 10x või 15x objektiiv). Treponema pallidum'i võib leida ka värvilistest preparaatidest. Värvimisel Romanovsky-Giemsa järgi värvuvad kahvatu treponeemid roosaks, Fontani ja Morozovi järgi pruuniks (mustaks), Burri meetodi järgi ilmnevad peitsimata treponeemid tumedal taustal.

Seroloogiline diagnoos

Süüfilise diagnoosimisel, ravi efektiivsuse hindamisel, ravikriteeriumi määramisel ja varjatud, resistentsete vormide tuvastamisel on suur tähtsus standardsetel (klassikalistel) ja spetsiifilistel seroloogilistel reaktsioonidel. Standardsed või klassikalised seroloogilised reaktsioonid (SSR) hõlmavad järgmist:

• Wassermani reaktsioon (WR),
• Kahni ja Sachs-Vitebsky settereaktsioonid (tsütokoolsed),
• reaktsioon klaasile (ekspressmeetod),

konkreetseks:

• Treponema pallidum immobilisatsioonireaktsioon (treponema pallidum'i reaktsioon),
• immunofluorestsentsreaktsioon (RIF).

Wassermani reaktsioon (WR)

- töötas välja A. Wasserman koos A. Neisseri ja C. Bruckiga 1906. aastal. Wassermani reaktsioon põhineb komplemendi sidumise fenomenil (Bordet-Gengou reaktsioon) ja võimaldab määrata lipiidivastaseid antikehi (reagins). Kaasaegsete kontseptsioonide kohaselt tuvastab Wassermani reaktsioon makroorganismi lipiidide, mitte Treponema pallidum'i antikehi ja reaktsioon paljastab autoimmuunprotsessi, mis on põhjustatud makroorganismi kudede denatureerimisest Treponema pallidum'i poolt koos lipoproteiinikompleksi moodustumisega ( konjugaat), milles lipiidid (hapteenid) on määrajateks.

RV diagnoositakse tavaliselt kahe või kolme antigeeniga. Kõige sagedamini kasutatakse ülitundlikku kardiolipiini antigeeni (kolesterooli ja letsitiiniga rikastatud veise südameekstrakt) ja treponemaalset antigeeni (anatogeense kultiveeritud treponemes pallidum'i ultraheliga töödeldud suspensiooni). Koos patsiendi seerumi reagiinidega moodustavad need antigeenid immuunkompleksi, mis on võimeline komplementi adsorbeerima ja siduma. Moodustunud kompleksi (reagins + antigeen + komplement) visuaalseks määramiseks kasutatakse indikaatorina hemolüütilist süsteemi (lamba erütrotsüütide segu hemolüütilise seerumiga). Kui reaktsiooni 1. faasis seotakse komplement (reagins + antigeen + komplement), hemolüüsi ei toimu - punased verelibled sadestuvad kergesti märgatavaks sademeks (PB positiivne). Kui 1. faasis komplement ei seondu reagiinide puudumise tõttu testitavas seerumis, kasutab seda hemolüütiline süsteem ja toimub hemolüüs (RT-negatiivne). Hemolüüsi raskusastet RV staadiumis hinnatakse plussidega: hemolüüsi täielik puudumine ++++ või 4+ (RV on järsult positiivne); vaevu alanud hemolüüs +++ või 3+ (RV positiivne); oluline hemolüüs ++ või 2+ (RV nõrgalt positiivne); ebaselge hemolüüsi pilt ± (RV on kaheldav); täielik hemolüüs - (Wassermanni reaktsioon negatiivne).

Lisaks PB kvalitatiivsele hindamisele toimub ka kvantitatiivne hindamine erinevate seerumi lahjendustega (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Reagiini tiiter määratakse maksimaalse lahjenduse järgi, mis annab siiski teravalt positiivse (4+) tulemuse. RV kvantitatiivne staadium on oluline süüfilise infektsiooni mõnede kliiniliste vormide diagnoosimisel, samuti ravi efektiivsuse jälgimisel. Praegu viiakse Wassermani reaktsioon läbi kahe antigeeniga (kardiolipiini ja treponemaalse häälega Reiteri tüvi). Reeglina muutub RV positiivseks 5-6 nädalat pärast nakatumist 25-60% patsientidest, 7-8 nädala jooksul - 75-96%, 9-19 nädala jooksul - 100%, kuigi viimastel aastatel mõnikord varem. või hiljem. Samal ajal suureneb reagiini tiiter järk-järgult ja saavutab generaliseerunud lööbe (sekundaarne värske süüfilis) korral maksimumväärtuse (1:160-1:320 ja üle selle). Kui RV on positiivne, diagnoositakse esmane seropositiivne süüfilis.
Sekundaarse värskega ja sekundaarne korduv süüfilis on RV positiivne 100% patsientidest, kuid nõrgenenud immuunsusega ammendunud patsientidel võib täheldada negatiivset tulemust. Seejärel reagiini tiiter järk-järgult väheneb ja sekundaarse korduva süüfilise korral ei ületa see tavaliselt 1:80-1:120.
Tertsiaarse süüfilise korral RV on positiivne 65–70% patsientidest ja tavaliselt täheldatakse madalat reagiini tiitrit (1:20–1:40). Süüfilise hilistes vormides (siseorganite, närvisüsteemi süüfilis) täheldatakse positiivset RV-d 50-80% juhtudest. Reagiini tiiter on vahemikus 1:5 kuni 1:320.
Latentse süüfilise korral positiivset RV-d täheldatakse 100% patsientidest. Reagiini tiiter on vahemikus 1:80 kuni 1:640 ja hilise latentse süüfilise korral 1:10 kuni 1:20. Reagiini tiitri kiire langus (kuni täieliku negatiivsuseni) ravi ajal näitab ravi efektiivsust.

Wassermani reaktsiooni puudused- ebapiisav tundlikkus (negatiivne esmase süüfilise algstaadiumis). Samuti on see negatiivne 1/3 patsientidest, kui neid on varem antibiootikumidega ravitud, tertsiaarse aktiivse süüfilisega patsientidel, kellel on naha ja limaskestade, osteoartikulaarse aparatuuri, siseorganite, kesknärvisüsteemi kahjustused ja hilise kaasasündinud kahjustused. süüfilis.
Konkreetsuse puudumine- Wassermani reaktsioon võib olla positiivne inimestel, kes ei ole varem süüfilist põdenud ega põe. Eelkõige täheldatakse valepositiivseid (mittespetsiifilisi) RV tulemusi patsientidel, kes põevad süsteemset erütematoosluupust, leepra, malaariat, pahaloomulisi kasvajaid, maksakahjustusi, ulatuslikku müokardiinfarkti ja muid haigusi ning mõnikord ka täiesti tervetel inimestel.
Tuvastatakse lühiajaline valepositiivne Wassermani reaktsioon mõnel naisel enne või pärast sünnitust, narkomaanidel, pärast anesteesiat või alkoholi tarvitamist. Valepositiivne RV on reeglina nõrgalt väljendunud, sageli madala reagiinitiitriga (1:5-1:20), positiivse (3+) või nõrgalt positiivse (2+). Massiliste seroloogiliste uuringute käigus on valepositiivsete tulemuste sagedus 0,1-0,15%. Ebapiisava tundlikkuse ületamiseks kasutavad nad külmatesti (Kolyari reaktsioon) ja samal ajal viiakse see läbi teiste seroloogiliste reaktsioonidega.

Kahni ja Sachs-Vitebsky settereaktsioonid

Wassermani reaktsiooni kasutatakse kombinatsioonis kahega settereaktsioonid (Kahn ja Sachs-Vitebsky), valmistatakse lavastamise korral kontsentreeritumad antigeenid. Ekspressmeetod (mikroreaktsioon klaasil) – viitab lipiidireaktsioonidele ja põhineb sadestamisreaktsioonil. See asetatakse spetsiifilise kardiolipiini antigeeniga, millest 1 tilk segatakse 2-3 tilga uuritava vereseerumiga spetsiaalse klaasplaadi süvenditesse.
Eelis- vastuse saamise kiirus (30-40 minutiga). Tulemusi hinnatakse ladestunud setete hulga ja helveste suuruse järgi. Väljenduslikkus on määratletud kui CSR – 4+, 3+, 2+ ja negatiivne. Tuleb märkida, et valepositiivseid tulemusi täheldatakse sagedamini kui RV puhul. Reeglina kasutatakse ekspressmeetodit süüfilise massiuuringuteks, kliiniliste diagnostika laborites, somaatilistes osakondades ja haiglates. Ekspressmeetodi tulemuste põhjal on süüfilise diagnoosimine keelatud, selle kasutamine rasedatel, doonoritel ja ka tõrjeks pärast ravi on välistatud.

Treponema pallidum immobilisatsioonireaktsioon (TPI)

Treponema pallidum immobilisatsioonireaktsioon (TPI)– pakkusid 1949. aastal välja R. W. Nelson ja M. Mayer. See on kõige spetsiifilisem süüfilise diagnostiline test. Kuid tootmise keerukus ja kõrge hind piiravad selle kasutamist. Patsientide vereseerumis määratakse videospetsiifilised antikehad (immobilisiinid), mis komplemendi juuresolekul põhjustavad Treponema pallidum'i liikumatust. Antigeen on elus patogeenne Treponema pallidum, mis on eraldatud süüfilisega nakatunud küülikutelt. Mikroskoobiga loendatakse kaotatud motoorika (immobiliseeritud) Treponema pallidum ja hinnatakse RIBT tulemusi: Treponema pallidum immobilisatsioon 51-100% on positiivne; 31 kuni 50% - nõrgalt positiivne; 21 kuni 30% - kaheldav; 0 kuni 20% - negatiivne.
RIBT on diferentsiaaldiagnostikas oluline eristada valepositiivseid seroloogilisi reaktsioone süüfilise põhjustatud reaktsioonidest. Hiline muutub positiivseks kui RV, RIF ja seetõttu seda ei kasutata süüfilise nakkuslike vormide diagnoosimiseks, kuigi süüfilise sekundaarsel perioodil on see positiivne 85-100% patsientidest.
Süüfilise tertsiaarsel perioodil koos siseorganite, lihasluukonna ja närvisüsteemi kahjustusega on RIBT positiivne 98–100% juhtudest ( RV on sageli negatiivne).
Tuleb meeles pidada, et RIBT võib olla valepositiivne, kui testitav seerum sisaldab treponemotsiidseid ravimeid (penitsilliin, tetratsükliin, makroliitid jne), mis põhjustavad Treponema pallidum'i mittespetsiifilist immobilisatsiooni. Sel eesmärgil analüüsitakse verd RIBT suhtes mitte varem kui 2 nädalat pärast antibiootikumide ja muude ravimite võtmise lõppu.
RIBT, nagu ka RIF, on raviprotsessi käigus aeglaselt negatiivne, mistõttu seda ei kasutata raviprotsessis kontrollina.

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF)

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF)- töötas välja 1954. aastal A. Coons ja kasutas esmakordselt süüfilise infektsiooni diagnoosimiseks Deacon, Falcone, Harris 1957. aastal. RIF põhineb fluorestseeruvate antikehade määramise kaudsel meetodil. Tootmiseks mõeldud antigeen on koepatogeenne Treponema pallidum, mis on fikseeritud alusklaasidele, millele kantakse uuritav seerum. Kui uuritav seerum sisaldab IgM-i ja IgG-ga seotud treponemaalseid antikehi, seonduvad need tugevalt antigeeniga – treponeemiga, mis tuvastatakse fluorestsentsmikroskoobis, kasutades liigivastast ("inimesevastast") fluorestseeruvat seerumit.
RIF-i tulemused võetakse arvesse preparaadis kahvatu treponema sära intensiivsuse järgi (kollane-roheline kuma). Treponemavastaste antikehade puudumisel seerumis ei tuvastata treponema pallidum'i. Antikehade juuresolekul tuvastatakse kahvatu treponema sära, mille astet väljendatakse plussides: 0 ja 1+ - negatiivne reaktsioon; 2+ kuni 4+ - positiivne.
RIF viitab grupi treponemaalsetele reaktsioonidele ja seda manustatakse testitava seerumi 10- ja 200-kordses lahjenduses (RIF-10 ja RIF-200). RIF-10 peetakse tundlikumaks, kuid sageli saadakse mittespetsiifilisi positiivseid tulemusi kui RIF-200 puhul (sellel on kõrgem spetsiifilisus). Tavaliselt, RIF muutub positiivseks varem kui RV- positiivne primaarse seronegatiivse süüfilise korral 80% patsientidest, 100% süüfilise sekundaarses perioodis, alati positiivne latentse süüfilise ja 95-100% juhtudest hiliste vormide ja kaasasündinud süüfilise korral.
RIF-i spetsiifilisus suureneb pärast testitava seerumi eeltöötlust sorbent-ultraheli treponemaalse antigeeniga, mis seob rühmaantikehi (RIF - abs).
RIBT ja RIF näidustused- latentse süüfilise diagnoosimine, et kinnitada lipiidreaktsioonide kompleksi spetsiifilisust süüfilise infektsiooni kahtluse korral positiivse RV põhjal. Positiivne RIBT ja RIF on latentse süüfilise tõendid. Valepositiivse RV korral erinevate haiguste korral (süsteemne erütematoosluupus, pahaloomulised kasvajad jne) ning korduvate RIBT ja RIF-i tulemuste korral viitab see RV mittespetsiifilisusele. Siseorganite, lihasluukonna, närvisüsteemi hilise süüfilise kahjustuse kahtlus, kui patsientidel on negatiivne RV. Primaarse seronegatiivse süüfilise kahtlus, kui patsientidel, kellel on korduvalt uuritud erosiooni (haavandi) pinnalt väljutamist, laienenud piirkondlike lümfisõlmede punktsiooni, ei tuvastata treponema pallidum - sel juhul antakse ainult RIF-10.
Negatiivse RV-ga isikute uurimisel kellel oli pikaajalisi seksuaal- ja majapidamiskontakte süüfilisega patsientidega, võttes arvesse tõenäolist võimalust ravida neid lähiminevikus süüfilisevastaste ravimitega, mis põhjustasid RV-negatiivsust. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA – ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs) – meetod, mille on välja töötanud E. Engvall et al., S. Avrames (1971). Põhiolemus seisneb tahkefaasilise kandja pinnale sorbeeritud süüfilise antigeeni kombineerimises uuritavast vereseerumist pärineva antikehaga ja spetsiifilise antigeen-antikeha kompleksi tuvastamises, kasutades ensüümiga märgistatud liigivastast immuunvereseerumit. See võimaldab teil ELISA tulemusi visuaalselt hinnata substraadi värvuse muutumise astme järgi konjugaadis sisalduva ensüümi toimel. Ebausaldusväärsed ELISA tulemused võivad tekkida koostisosade ebapiisava lahjendamise, temperatuuri- ja ajatingimuste rikkumise, lahuste pH ebaühtluse, laboratoorsete klaasnõude saastumise ja söötme vale pesemistehnika tõttu.

Passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon (RPHA)

Süüfilise diagnostiliseks testiks pakkusid välja T.Rathlev (1965,1967), T.Tomizawa (1966). Reaktsiooni makromodifikatsiooni nimetatakse TRHA-ks, mikromodifikatsiooniks MNA-TR, automatiseeritud versiooniks AMNA-TR, reaktsiooniks punaste vereliblede asemel polüuurea makrokapslitega on MSA-TR. RPGA tundlikkus ja spetsiifilisus on sarnased RIBT-le, RIF-ile, kuid RPGA-l on süüfilise varajaste vormide puhul väiksem tundlikkus võrreldes RIF-absiga ja suurem tundlikkus kaasasündinud süüfilise hilisemate vormide puhul. RPGA-d tarnitakse kvalitatiivsetes ja kvantitatiivsetes versioonides.

Verevõtu tehnika seroloogiliste testide jaoks

RV, RIF, RIBT uurimiseks võetakse steriilse süstla või ühe nõela abil veri küünarluuveenist tühja kõhuga või mitte varem kui 4 tundi pärast sööki. Kogumiskohas töödeldakse nahka eelnevalt 70% alkoholiga. Süstlat ja nõela tuleb pesta isotoonilise naatriumkloriidi lahusega. 5-7 ml uuritavat verd valatakse puhtasse, kuiva ja külma katseklaasi. Katseklaasi kleebitakse tühi paber patsiendi perekonnanime, initsiaalide, haiguslugu või ambulatoorse kaardi numbriga ja verevõtu kuupäevaga. Pärast vere võtmist asetatakse katseklaas järgmise päevani külmkappi, mille temperatuur on +4°+8°C. Järgmisel päeval kurnatakse seerum testimiseks. Kui järgmisel päeval verd ei kasutata, tuleb seerum trombist välja tõmmata ja hoida külmkapis mitte üle 1 nädala. RIBT testimiseks peab katseklaas olema spetsiaalselt ette valmistatud ja steriilne. Uurimiseks vere kogumise reeglite rikkumise korral võib tingimuste täitmata jätmine kaasa tuua tulemuste moonutamise.
Verd ei ole soovitatav võtta analüüsiks pärast söömist, alkoholi tarvitamist, erinevate ravimite võtmist, pärast erinevate vaktsiinide manustamist ega naistel menstruaaltsükli ajal.
Ekspressmeetodil uurimiseks võeti verd sõrme otsast, nagu seda tehakse ESR-i võtmisel, kuid verd võeti 1 kapillaarist rohkem. Ekspressmeetodit saab läbi viia ka veenipunktsiooniga saadud vereseerumiga. Kui tekib vajadus vereanalüüsiks kauglaborites, võib vere asemel saata kuivseerumit (dry drop meetod). Selleks eraldatakse seerum järgmisel päeval pärast vere võtmist trombist ja tõmmatakse steriilsesse süstlasse koguses 1 ml. Seejärel valatakse seerum 2 eraldi ringi kujul 6x8 cm paksule kirjutuspaberi (vahapaber või tsellofaan) ribale, mille vabale servale kirjutatakse perekonnanimi, uuritava initsiaalid ja vereproovi võtmise kuupäev. paber. Seerumiga paber on kaitstud otsese päikesevalguse eest ja jäetakse järgmise päevani toatemperatuurile. Seerum kuivab läikiva kollaka klaasja kile väikeste ringidena. Pärast seda rullitakse kuivanud seerumiga paberiribad kokku nagu ravimipulber ja saadetakse laborisse, märkides ära diagnoosi ja uurimise eesmärgi.

Seroloogiline resistentsus

Mõnedel (2% või enam) süüfilisega patsientidel, vaatamata täielikule antisüüfilisele ravile, on negatiivsete seroloogiliste reaktsioonide aeglustumine (puudumine) pärast ravi lõppu kuni 12 kuud või kauem. Tekib nn seroloogiline resistentsus, mida on viimastel aastatel sageli täheldatud. On olemas seroloogilise resistentsuse vorme:

• Tõsi(absoluutne, tingimusteta) - on vaja läbi viia täiendav süüfilisevastane ravi, kombineerides seda mittespetsiifilise raviga, et suurendada keha immuunjõude.
• Sugulane- pärast täielikku ravi moodustuvad pallid treponema tsüstid ehk L-vormid, mis on organismis vähevirulentses olekus ja sellest tulenevalt ei muuda lisaravi seroloogiliste reaktsioonide, eriti RIF ja RIBT näitajaid.

Samal ajal toimuvad tsüstvormides väiksemad ainevahetusprotsessid ja tsüstivormide kestad on võõrvalk (antigeen). Enda kaitsmiseks toodab organism spetsiifilisi antikehi, mis on positiivsed või tugevalt positiivsed, kui tehakse seroloogilisi reaktsioone ja haiguse ilminguid ei esine. L-vormide puhul on metaboolsed protsessid rohkem vähenenud ja antigeensed omadused puuduvad või on veidi väljendunud. Spetsiifilisi antikehi ei toodeta või on neid vähe, seroloogilised reaktsioonid on nõrgalt positiivsed või negatiivsed. Mida pikem on ajavahemik nakatumise hetkest, seda suurem on Treponema pallidumite arv, mis muundub ellujäämisvormideks (tsüstid, eosed, L-vormid, terad), mille puhul antisüüfiline ravi ei ole efektiivne.

Pseudoresistentsus- pärast ravi, hoolimata positiivsetest seroloogilistest reaktsioonidest, puudub Treponema pallidum organismis. Antigeeni organismis ei ole, kuid antikehade tootmine jätkub, mis avastatakse seroloogiliste reaktsioonide käigus.
Seroloogiline resistentsus võib tekkida järgmistel põhjustel:

• ebapiisav ravi, võtmata arvesse haiguse kestust ja staadiumi;
• ebapiisav annus ja eelkõige patsientide kehakaalu arvestamata jätmise tõttu;
• ravimi manustamise vahelise intervalli rikkumine;
• Treponema pallidum'i püsimine organismis vaatamata täielikule spetsiifilisele ravile nende resistentsuse tõttu penitsilliini ja teiste keemiaravi ravimite suhtes siseorganite, närvisüsteemi, lümfisõlmede varjatud, tsüstitud kahjustuste korral, mis on antibakteriaalsete ravimitega kättesaamatud (treponema pallidum). sageli leitakse armkudedes palju aastaid pärast ravi lõppu, lümfisõlmedes on mõnikord võimalik tuvastada treponema pallidum 3-5 aastat pärast antisüüfilist ravi);
• kaitsejõudude vähendamine erinevate haiguste ja mürgistuste korral (endokrinopaatiad, alkoholism, narkomaania jne);
• üldine kurnatus (vitamiini-, valkude-, rasvavaese toidu söömine).

Lisaks tuvastatakse sageli seroloogiliste reaktsioonide valepositiivsus, mis ei ole seotud süüfilise esinemisega patsientidel ja on põhjustatud:

• kaasuvad siseorganite mittespetsiifilised haigused, kardiovaskulaarsüsteemi häired, reuma, endokriin- ja närvisüsteemi talitlushäired, rasked kroonilised dermatoosid, pahaloomulised kasvajad;
• närvisüsteemi kahjustus (rasked vigastused, põrutus, vaimne trauma);
• Rasedus; krooniline mürgistus alkoholi, nikotiini, narkootikumidega; nakkushaigused (malaaria, tuberkuloos, viirushepatiit, düsenteeria, tüüfus, kõhutüüfus ja korduv palavik).

Need tegurid võivad mõjutada keha immunoloogilist reaktiivsust nii süüfilise ilmingute aktiivse arengu perioodil kui ka nende taandarengu ajal.