Реакция пассивной, или непрямой, гемагглютинации (рпга, рнга). Реакция непрямой гемагглютинации (рнга) Реакция обратной гемагглютинации

Лабораторная диагностика практически всех инфекционных заболеваний основана на выявлении в крови больного антител, которые вырабатываются на антигены возбудителя, методами серологических реакций. Они вошли во врачебную практику с конца девятнадцатого - начала двадцатого века.

Развитие науки помогло определить антигенную структуру микробов и химические формулы их токсинов. Это позволило создать не только лечебные, но и диагностические сыворотки. Их получают путем введения ослабленных возбудителей лабораторным животным. После нескольких дней выдержки из крови кроликов или мышей готовят препараты, используемые для идентификации микробов или их токсинов, используя серологические реакции.

Внешнее проявление такой реакции зависит от условий ее постановки и от состояния антигенов в крови больного. Если частички микробов нерастворимы, то они осаждаются, лизируются, связываются или иммобилизуются в сыворотке. Если антигены растворимы, то проявляется феномен нейтрализации или преципитации.

Реакция агглютинации (РА)

Серологическая реакция агглютинация является высокоспецифичной. Она проста в исполнении и достаточно наглядна, чтобы быстро определить наличие антигенов в сыворотке крови больного. Ее используют для постановки реакции Видаля (диагностика брюшного тифа и паратифа) и Вейгля (сыпной тиф).

Она основана на специфическом взаимодействии между антителами человека (или агглютининами) и микробными клетками (агглютеногенами). После их взаимодействия образуются частицы, которые выпадают в осадок. Это и есть положительный признак. Для постановки реакции могут использоваться живые или убитые микробные агенты, грибы, простейшие, и соматические клетки.

Химически реакция разбита на два этапа:

1. Специфическое соединение антител (АТ) с антигенами (АГ).
2. Неспецифическая - осаждение конгломератов АГ-АТ, то есть образование агглютината.

Реакция непрямой агглютинации (РПГА)

Для ее постановки используют очищенные бараньи эритроциты и красные кровяные тельца человека, предварительно обработанные антителами или антигенами (это зависит от того, что именно лаборант хочет найти). В некоторых случаях человеческие эритроциты обрабатывают иммуноглобулинами. Серологические реакции эритроцитов считаются состоявшимися, если произошло их осаждение на дно пробирки. О положительной реакции можно говорить, когда клетки располагаются в виде перевернутого зонтика, занимая все дно. Отрицательная реакция засчитывается, если эритроциты осели столбиком или в виде пуговки в центре дна.

Реакция преципитации (РП)

Серологические реакции этого типа служат для выявления крайне малых частиц антигенов. Это могут быть, например, белки (или их части), соединения белков с липидами или углеводами, части бактерий, их токсины.

Сыворотки для проведения реакции получают путем искусственного заражения животных, обычно кроликов. Таким методом можно получит абсолютно любую преципитирующую сыворотку. Постановка серологических реакций преципитации похожа по механизму действия на реакции агглютинации. Антитела, содержащиеся в сыворотке, соединяются с антигенами в образуя крупные белковые молекулы, которые осаждаются на дно пробирки или на субстрат (гель). Этот способ считается высокоспецифичным и может обнаружить даже ничтожно малые количества вещества.

Используется для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний. Кроме того, задействован в судебно-медицинской экспертизе.

в геле

Серологические реакции можно проводить не только в жидкой среде, но и в агаровом геле. Это называется метод диффузной преципитации. С его помощью изучают состав сложных антигенных смесей. Этот способ основан на хемотаксисе антигенов к антителам и наоборот. В геле они движутся навстречу друг другу с разной скоростью и, встречаясь, образуют линии преципитации. Каждая линия - один комплект АГ-АТ.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Антитоксические сыворотки способны нейтрализовать действие экзотоксина, который вырабатывают микроорганизмы. На этом и основаны данные серологические реакции. Микробиология использует этот способ для титрования сывороток, токсинов и анатоксинов, а также определения их лечебной активности. Сила нейтрализации токсина определяется условными единицами - АЕ.

Кроме того, благодаря этой реакции можно определить видовую или типовую принадлежность экзотоксина. Это применяется при дифтерии, ботулизма. Исследование можно проводить как «на стекле», так и в геле.

Реакция лизиса (РЛ)

Иммунная сыворотка, которая попадает в организм больного, обладает, кроме своей основной функции пассивного иммунитета, еще и лизирующими свойствами. Она способна растворять микробные агенты, клеточные чужеродные элементы и вирусы, поступающие в организм больного. В зависимости от специфичности входящих в состав сыворотки антител выделяют бактериолизины, цитолизины, спирохетолизины, гемолизины и другие.

Эти специфические антитела называются "комплемент". Он содержится практически во всех жидкостях тела человека, имеет сложную белковую структуру и крайне чувствителен к повышению температуры, встряхиванию, действию кислот и прямых солнечных лучей. Но в высушенном состоянии способен сохранять свои лизирующие свойства до полугода.

Существуют такие виды серологических реакций этого типа:

Бактериолиз;

Гемолиз.

Бактериолиз проводят, используя сыворотку крови пациента и специфическую иммунную сыворотку с живыми микробами. Если в крови присутствует достаточное количество комплемента, то исследователь увидит лизис бактерий, и реакция будет считаться положительной.

Вторая серологическая реакция крови заключается в том, что взвесь эритроцитов больного обрабатывают сывороткой, содержащей гемолизины, которые активизируются только в присутствии определенного комплимента. Если таковой имеется, то лаборант наблюдает растворение красных клеток крови. Данная реакция широко используется в современной медицине для определения титра комплемента (то есть его наименьшего количества, провоцирующего лизис эритроцитов) в сыворотке крови и для постановки анализа на связывание комплемента. Именно этим способом проводится серологическая реакция на сифилис -

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эта реакция используется для того, чтобы обнаружить в сыворотке крови больного антитела к инфекционному агенту, а также с целью идентифицировать возбудителя по его антигенной структуре.

До этого момента мы описывали простые серологические реакции. РСК считается сложной реакцией, так как в ней взаимодействуют не два, а три элемента: антитело, антиген и комплемент. Суть ее заключается в том, что взаимодействие между антителом и антигеном происходит только в присутствии белков комплимента, которые адсорбируются на поверхности образовавшегося комплекса АГ-АТ.

Сами антигены, после присоединения комплемента, подвергаются существенным изменениям, которые и показывают качество проведенной реакции. Это может быть лизис, гемолиз, иммобилизация, бактерицидное или бактериостатическое действие.

Сама реакция происходит в две фазы:

1. Образование комплекса антиген-антитело, которое визуально не заметно исследователю.
2. Изменение антигена под действием комплемента. Эта фазу чаще всего можно отследить невооруженным глазом. Если же визуально реакции не видно, то используют дополнительную индикаторную систему, позволяющую выявить изменения.

Индикаторная система

Данная реакция основана на связывании комплемента. В исследуемую пробирку спустя час после постановки РСК добавляют очищенные эритроциты барана и гемолитическую сыворотку, не содержащую комплемента. Если в пробирке остался несвязанный комплемент, то он присоединится к комплексу АГ-АТ, образованному между бараньими клетками крови и гемолизином, и вызовет их растворение. Это будет означать, что РСК отрицательна. Если эритроциты остались целыми, то, соответственно, реакция положительная.

Реакция гемагглютинации (РГА)

Существуют две принципиально разные реакции гемагглютинации. Одна из них - серологическая, она используется для определения групп крови. В этом случае эритроциты взаимодействуют с антителами.

А вторая реакция не относится к серологическим, так как красные кровяные тельца реагируют с гемагглютининами, продуцируемыми вирусами. Так как каждый возбудитель действует только на конкретные эритроциты (куриные, бараньи, обезьяньи), то можно считать эту реакцию узкоспецифичной.

Понять, положительная реакция или отрицательная, можно по расположению клеток крови на дне пробирки. Если их рисунок напоминает перевернутый зонтик, значит, искомый вирус присутствует в крови больного. А если все эритроциты сложились наподобие монетного столбика, то искомых возбудителей нет.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это высокоспецифичная реакция, позволяющая установить вид, тип вирусов или наличие специфических антител в сыворотке крови пациента.

Суть ее заключается в том, что антитела, добавленные в пробирку с исследуемым материалом, препятствую осаждению антигенов на эритроцитах, тем самым останавливая гемагглютинацию. Это и является качественным признаком наличия в крови специфических антигенов к конкретному искомому вирусу.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В основе реакции лежит способность выявлять комплексы АГ-АТ при после их обработки флюорохромными красителями. Это метод прост в обращении, не требует выделения чистой культуры и занимает мало времени. Он незаменим для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

В практике эти серологические реакции делятся на два вида: прямые и непрямые.

Прямая РИФ производится с антигеном, который заранее обработан флюоресцирующей сывороткой. А непрямая заключается в том, что сначала препарат обрабатывают обычным диагностикумом, содержащим антигены к искомым антителам, а затем повторно наносится люминесцентная сыворотка, которая специфична к белкам комплекса АГ-АТ, и микробные клетки становятся заметны при микроскопии.

Реакция прямой агглютинации микробов (РА). В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютаногены). Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации). По характеру образующегося агглютината различают зернистую и хлопьевидную агглютинацию. Зернистая агглютинация происходит при склеивании микробов, содержащих О-антиген. Бактерии, имеющие жгутики (Н-антиген), агглютинируются с образованием крупных хлопьев.

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки. Их получают гипериммунизацией лабораторных животных взвесью бактерий. Титром такой сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена. Однако из-за сложности антигенной структуры бактерий, агглютинирующие сыворотки содержат антитела не только к видоспецифическим, но и к групповым антигенам и могут давать групповую агглютинацию с родственными видами бактерий. Титры антител к видоспецифическим антигенам в сыворотке всегда выше, чем к групповым. Для удаления группоспецифических антител в сыворотку последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят групповые антигены (метод Кастеллани). Таким методом получают адсорбированные сыворотки, которые содержат антитела к определенному виду микроба.

Методы реакции агглютинации. Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА.

Пластинчатую РА ставят на стекле. В этой реакции используют сыворотки с небольшим разведением или неразведенные. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов. На стекло наносят каплю сыворотки, в которую петлей вносят неизвестную культуру бактерий, перемешивают и через 2-3 минуты наблюдают появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации. Для контроля используют каплю физиологического раствора, в которой после внесения бактерий наблюдается помутнение. При использовании неадсорбированных сывороток реакция на стекле имеет только ориентировочное значение.

Развернутую РА проводят в пробирках или лунках пластин. При этом диагностическую сыворотку разводят до титра и вносят одинаковые количества антигена. При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок в виде " зонтика", при отрицательном - осадок в виде " пуговицы". Поскольку титры группоспецифических антител в сыворотке значительно ниже, чем титр видоспецифических, групповые реакции наблюдаются лишь в небольших разведениях сыворотки. Если агглютинация происходит до титра или до половины титра сыворотки, она является видоспецифэтеской.

Для определения антител в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум, содержащий взвесь известных микробов или их антигенов. В этом случае также можно ставить пластинчатую и развернутую РА.

Реакция прямой агглютинации клеток. Для определения групп крови используют стандартные сыворотки крови доноров, содержащие известные анти-А или анти-В антитела. Реакции ставят на стекле или пластинах. При наличии на эритроцитах А (2-я группа крови), В (3-я группа крови) или обоих антигенов (4-я группа крови) соответствующие сыворотки агглютинируют эритроциты. Применяется также проба на совместимость крови, когда капли крови донора и реципиента смешивают и оценивают агглютинацию.

В клиниках применяют реакцию агглютинации лейкоцитов, тромбоцитов и других клеток для выявления аутоантител, а также для определения антигенов на этих клетках.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.
При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение . РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов.

· Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами.

· После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению.

· Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум.

· Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки.

· Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

· Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции - харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями

Реакция коагглютинации.

В основу этой реакции положено уникальное свойство золотистого стафилококка, имеющего в составе своей клеточной стенки белок А, связываться с Fc-фрагментами IgG и IgM.

При этом активные центры антител остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигенов. На предметное стекло наносят каплю 2%-ной взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, и добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий. При соответствии антигена антителам через 30-60 с происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков.

Требования к иммунной сыворотке, используемой для сенсибилизации клеток стафилококка, и проведение процесса сенсибилизации . Для получения коагглютинирующего реагента взвесь стафилококков следует обработать иммунной сывороткой против искомого антигена. Сыворотка должна быть взята от животного, IgG которого обладает сродством к белку А. Наибольшим сродством к нему обладают иммуноглобулины человека, свиньи, собаки и морской свинки, меньшим - осла и кролика, a IgG овцы, лошади, крысы и мыши взаимодействуют с ним очень слабо.

Помимо строгой специфичности к искомому антигену сыворотка, используемая в РКОА, не должна содержать антител к стафилококку, чтобы избежать агглютинации стафилококкового реагента, обусловленной специфическим воздействием антигена и антител, которая в системе IgG - белок А должна быть исключена. Контроль проводят путем смешивания на стекле одной капли сыворотки и 10%-й суспензии стафилококкового реагента. Если по истечении 3…5 мин не образуются хлопья агглютината, то сыворотку считают пригодной для реакции.

Если имеющиеся образцы сывороток к этому антигену агглютинируют стафилококк, то можно провести их адсорбцию взвесью стафилококковых клеток, не имеющих белка А (например, штаммы Wood-46). Таким путем удаляют антитела, реагирующие со стафилококком за счет Fab-фрагментов.

Таким образом, сыворотка, применяемая для приготовления коагглютинирующего реагента, должна отвечать следующим требованиям:

• получена от животного-продуцента, IgG которого обладает сродством к белку А;
• должна обладать специфичностью по отношению к искомому антигену;
• быть свободна от противостафилококковых антител.

· Приготовление диагностикума . Приготовленный 10%-й стафилококковый реагент соединяют с равным объемом иммунной сыворотки в определенном ранее оптимальном рабочем разведении. Смесь встряхивают в течение 60 мин при 40…42 °С в шутгель-аппарате при 90 колебаниях в 1 мин. Затем через 15 мин дважды отмывают ФБР, ресуспензируют до 2%-й взвеси и консервируют мертиолатом натрия (1: 10 000).

В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами. называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.

Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Реакция пассивной гемагглютинации является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунопогического состояния привитых. У больных туляремией aнтитела обычно обнаруживаются в конце 1-ой или на 2-ой неделе заболевания, через 1-1,5 месяца титры РПГА достигают максимальных показателей (1:100000- 1:20000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное время.

У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако, в более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 месяца после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20-1:80.

Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат - 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах - в 0,5%-ноq концентрации.

Техника постановки РПГА. Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5 (1:10) и прогревают при 56 град.С в течение 30 минут. После этого в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам, сыворотки обрабатывают 50%-ной взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием. Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют после одночасовой выдержки при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.

Разводящую жидкость разливают в объеме 0,5 мл в ряд лунок полистироловой пластины. При предварительном исследовании сывороток их целесообразно испытывать путем постановки реакции в коротком ряду пластины (6-лунок). В случае выявления антител в коротком ряду сыворотки повторно исследуют в длинном ряду разведений (12 лунок). После разлива разводящей жидкости, в первую лунку каждого ряда (короткого или длинного) добавляют по 0,5 мл испытуемых сывороток в разведении 1:5. Затем в тех же объемах сыворотки титруют двукратными разведениями. Таким образом, получают разведения сыворотки в коротком ряду с 1:10 до 1:320, а в длинном - с 1:10 до 1:20480. После титрования сывороток в каждую лунку добавляют по одной капле (0,05 мл) рабочей 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Содержимое пластин тщательно встряхивают до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре на неподвижной поверхности стола. Предварительный учет реакции производят через 2-3 часа, окончательное определение титра производят после полного оседания эритроцитов в лунках. К реакции предусматривают следующие контроли: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:10 в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 2) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 3) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Все контроли должны дать четко отрицательную реакцию.

Учет и оценка РПГА. Оценку реакции производят по следующей схеме:

1) резко положительная реакция (++++) - эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», у которого нередко наблюдается фестончатое оплывание краев;

2) положительная реакция (+++) - эритроциты устилают не менее 2/3 дна лунки;

3) слабоположительная реакция (++) - агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки;

4) сомнительная реакция (+) - вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютината;

5) отрицательная (-) - на дне лунки эритроциты оседают в виде «пуговки» или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.

Титр сыворотки учитывают по последнему разведению сыворотки, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов). Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так же как и в случае РА необходимо проследить за его нарастанием.

РПГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РПГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.

Техника постановки РПГА в микрообъемах. РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 мкл и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем макрометода.

Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки - капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забирают исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Следует убедиться, что жидкость заполнила головку титратора. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и, держа его в вертикальном положении, делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой (со сменой 2-х порций) путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.

В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума. Концентрация диагностикума для РПГА в микрообъемах должна составлять 0,5% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно разводят в 5 раз). После добавления эритроцитов пластины следует слегка потрясти до получения гомогенной взвеси. Учет результатов может быть произведен уже через 1-1,5 часа, в чем существенное преимущество РПГА в микротитраторе. Кроме того, этот прием требует малого количества всех ингредиентов реакции и испытуемых сывороток.

Учет реакции производят по следующей схеме:

1) «+» – полноценная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», занимающего не менее 2/3 дна;

2) «+-« - частичная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно в виде рыхлого кольца небольшого размера;

3) «-« – отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно в виде маленькой пуговки или колечка с ровным краем.

Специфичность положительного результата, полученного в РПГА, может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции – реакции mторможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Техника постановки РТПГА. Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РПГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум РТПГА обычно ставят в ряду из 7-8 лунок. Целесообразно параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА. В два ряда лунок разливают по 0,25 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов вносят испытуемую сыворотку в объеме 0,25 мл и производят титровании Получают два одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки второго ряда добавляют по 0,25 мл разводящей жидкости, а в лунки первого ряда - по 0,25 мл взвеси туляремийных бактерий. Используют туляремийный диагностикум (содержащий 25 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл), предварительно разведенный в 50 раз. Такая взвесь содержит 500 млн. бактерий в 1 мл или 125 млн. в объеме 0,25 мл. После добавления антигена пластину оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности стола. Учет производят через 2-3 часа.

Учет и оценка РТПГА. Если в испытуемой сыворотке содержатся специфические туляремийные антитела, они нейтрализуются добавленным антигеном и в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет, или, при высоком титре сыворотки, гемагглютинация будет отмечаться в меньшем (на 2-4) количестве лунок, чем в ряду с РПГА. В этом случае специфичность результатов подтверждена. Если же гемагглютинация будет отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РТПГА и РПГА совпадут, то это свидетельствует об отсутствии в испытуемой сыворотке туляремийных антител. В таком случае первичный результат РПГА признается неспецифическим.

Техника постановки РТПГА в микрообъемах. РТПГА, также как и РПГА, может быть выполнена в микрообъемах с использованием микротитратора типа Такачи. Для этого в лунки микропластинок вносят по 0,25 мкл разводящей жидкости в два ряда по 7-8 лунок в каждом. Затем с помощью титратора забивают по 0,25 мкл исследуемой сыворотки и титруют ее в обоих рядах. После этого в первый ряд вносят по 25 мкл туляремиймого антигена (концентрация которого 500 млн. туляремийных бактерий в 1 мл) в каждую лунку, а во второй - 25 мкл разводящей жидкости. Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют 25 мкл антигенного зритроцитарного диагностикума (0,5%-ной концентрации). Учет и оценку результатов производят аналогично реакции в макрообъемах.

Главная → Анализы → Иммунологический метод → Реакции гемагглютинации (иммунологический метод)

Реакции агглютинации основаны на взаимодействии реагента (антител) с антигенами, находящимися на поверхности клеток или инородных частиц. В результате образуются агрегаты крупного размера, которые выпадают в осадок и их можно увидеть даже невооруженным глазом. Таким образом определяют группу крови по системе АВО, наличие в ней резус-фактора и др. Это более чувствительный по сравнению с реакциями преципитации способ диагностики, так как объем осадка (агглютината) превосходит объем преципитата.

Прямая гемагглютинация

Реакция прямой гемагглютинации (РПГА) используется для выявления поверхностных антигенов микроорганизмов и эритроцитов, а также антител к ним.
К стандартным сывороткам, содержащим антитела, добавляют исследуемый материал (кровь). Скорость прямой реакции агглютинации связана с количеством исследуемого материала, количеством и концентрацией сыворотки, температурой окружающей среды.

Непрямая гемагглютинация

Реакцию непрямой гемагглютинации проводят для выявления антител в крови пациента с помощью эритроцитарного диагностикума. Реагент представляет собой эритроциты, на поверхности которых расположен антиген (белки микроорганизмов, токсинов, аллергенов и др.).
Сыворотку крови пациента разводят 0,9 %-ным раствором натрия хлорида, затем добавляют эритроцитарный диагностикум и отслеживают результат. Этот высокочувствительный способ диагностики выявляет антигены даже в небольших концентрациях.

Реакция гемагглютинации (РГА).

В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не

антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита — эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут.

Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками «+».

Реакция гемагглютинации

Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Эта реакция позволяет определить вид и тип вирусов.

Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки смешивают с равным объёмом материала, содержащего вирус. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 минут, после чего добавляют по 0,5 мл’1-2% взвеси эритроцитов.

Учёт результатов. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» — нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» — вирус вызвал агглютинацию эритроцитов. Если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» — сыворотка нейтрализовала вирус.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену.

Постановка реакции. Сыворотку прогревают 30 минут при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10 — 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитов с адсорбированными на них антигенами.

Контроли: взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с заведомо иммунной сывороткой, взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем её не должно быть.

Контрольные вопросы.

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли реакция агглютинации эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №12.

Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплимента (РСК) основана на том, что’ специфический комплекс антиген — антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов ив серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РКС-сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген-антитело. По существу, это две серологические реакции.

Правая система-основная состоит из антигена и антитела (один известный, др. нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплимент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый имунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой, то во второй системе гемолиза не будет- т.к. нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то имунный комплекс не образуется и комплимент останется свободным. Оставшийся свободным, комплимент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, результат РСК отрицательный(содержимое пробирок прозрачно-"лаковая кровь").

Компоненты, реакции связывания комплемента:

1. Антиген — обычно лизат, экстракт, гаптен,

реже взвесь микроорганизмов.

2. Антитело — сыворотка больного.

3. Комплемент — сыворотка морских свинок.

4. Антиген — эритроциты барана.

5. Антитело — гемолизин к эритроцитам барана.

6. Изотонический раствор.

Ввиду того, что в РСК участвует большое количество сложных компонентов,

они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25 , реже по 0,2,1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.

Похожая информация:

Поиск на сайте:

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.

1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного приме-няются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорби-рован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отноше-нии этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых план-шетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положитель-ной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кру-жевного зонтика», при отрицательной реакции — плотный осадок эрит-роцитов в виде "пуговки".

2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исс-ледуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагнос-тикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В от-ношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген па-лочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум?

Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами.

В РНГА выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

Методика постановки реакций. Реакция коагглютинации.

— фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
— обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
— сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Реакция коагглютинации (РКА)

Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум).
Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

Агглютинирующие сыворотки: что они содержат; как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки?

Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7-8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител.

Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом.

Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации.

Реакция гемагглютинации (РГА)

Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

В чём различия между поливалентными и моновалентными (монорецепторными) агглютинирующими сыворотками; почему при иммунизации кролика микробами одного вида получается сыворотка, содержащая антитела к нескольким антигенам?

Монорецепторные сыворотки — сыворотки, содержащие антитела толь-ко к одному антигену, и поливалентные сыворотки, дающие реакции аг-глютинации с двумя-тремя родственными бактериями, имеющими об-щий антиген. Агглютинирующие сыворотки применяют для идентификации микроорганизмов в реакции агглютинации. Недостатком таких сывороток является то, что они спо-собны давать групповые реакции агглютинации, т.к. они содержат ан-титела к бактериям, имеющим общие антигены.

Реакция гемагглютинации. Описание и применение

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
• смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
• учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Вконтакте

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Использование сорбированных диагностических препаратов основано на постоянно реализуемом в природе принципе иммунологического распознавания поверхностных структур. С этой точки зрения нет принципиальных различий между использованием, например, микробной клетки или искусственного носителя, нагруженных антигеном (антителами). В качестве основы сорбированных препаратов применяются различные носители - микробные клетки, эритроциты, латекс, бентонин, холестерин, сефадекс, дерматол, активированный уголь, споры грибов и т.д.

После работ А.Т.Кравченко (1945) наибольшее распространение в качестве носителя антигена или антител получили лишенные жизнеспособности и фиксированные различными химическими реагентами эритроциты. На принципе использования в качестве носителя антигена эритроцитов (как нативных, так и фиксированных) широкое распространение получила реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Предложение об использовании реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) в диагностических целях возникли на базе предварительно развитых знаний о высокой сорбиционной активности эритроцитов. По сравнению со многими другими носителями антигенов и антител в реакции непрямой гемагглютинации эритроциты имеют определенные преимущества. Во-первых, в изотонических солевых растворах они образуют довольно стойкое сцепление и не оседают за короткое время. Во-вторых, эритроциты одного и того же вида животных одинаковы по размеру. И, наконец, эритроциты сравнительно легко непосредственно или в результате специальной обработки присоединяют различные серологически активные компоненты.

Создание эритроцитарных диагностикумов из стабилизированных эритроцитов позволяет преодолеть те трудности, которые возникают при использовании нативных эритроцитов.

При исследовании эритроцитов, обработанных различными фиксирующими веществами, установлены некоторые их общие свойства:

По морфологии они практически не отличаются от свежих;

Не гемолизируются в гипотонических растворах, в воде и после замораживания-оттаивания;

Могут быть лиофильно высушены;

Их поверхностные структуры сохраняют способность химически модифицироваться (например, танином, диазосоединениями) и вступать в реакцию с антигенами и антителами.

Главный критерий качества фиксированных эритроцитов - возможность их использования для получения сенсибилизированных препаратов при отсутствии неспецифического склеивания в стабилизирующих жидкостях.

Подготовка поверхности эритроцитов с целью повышения сорбиционной способности к антигенам имеет важное значение при конструировании диагностических препаратов. Особенно широкое распространение получила обработка эритроцитов танином.

Под его влиянием изменяются антигенные свойства эритроцитов (проницаемость, скорость оседания), повышается их устойчивость к гемолитическому воздействию некоторых жирных кислот. Достигается, однако, главное - танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбиционной емкостью белков, что широко используется в настоящее время при изготовлении высококачественных антигенных и антительных диагностикумов.

Наряду с танизацией эритроцитов, для изготовления эритроцитарных диагностикумов и подготовки носителя антигена применяются такие химические реагенты, как бромелин, триопсин, перйодат калия, которые также модифицируют мембраны эритроцитов.

После подготовки поверхности эритроцитов идет наиболее важный процесс - процесс гемосенсибилизации - окончательный этап изготовления эритроцитарных диагностикумов.

Для упрочения связи между носителем и антигеном применяются различные конъюгирующие вещества - бисдиазобензидин, дифлуородинитробензин, хлористый циан, хлористый и уксуснокислый кадмий, хлорид брома, формальдегид, глютаровый альдегид, бромциан, риванол, амидол и др.

Использование конъюгирующих веществ способствует устранению тех недостатков, которые имеют танизированные эритроциты, применяемые для сенсибилизации без конъюгирующих веществ.

Наиболее широкое применение нашли такие конъюгирующие вещества, как хлорид хрома, глутаровый альдегид, диазоль черный С, амидол. Процесс сенсибилизации с помощью хлорида хрома происходит очень быстро - от 4 до 10 мин., чем привлекает внимание исследователей. При этом используются концентрации хлорида хрома от 0,05 до 2%, pH - не ниже 5,0 при температуре реакционной смеси 20- 250 С. В процессе сенсибилизации хлоридом хрома активизируются карбоксильные группы белков мембраны эритроцитов. В результате этого образуется ковалентная связь между мембраной эритроцитов и сенситином.

Реакция непрямой гемагглютинации обладает высокой специфичностью, поскольку склеивание эритроцитов наступает в результате взаимодействия антигена с антителами, адсорбированными на эритроцитах. Отличительной ее особенностью является высокая чувствительность: в ней выявляется 0,02-0,05 мкг белка антител. По чувствительности она значительно превосходит реакции иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, радиальной иммунодиффузии, связывания комплемента, нейтрализации. РНГА менее чувствительна, чем методы радиоиммуноэлектрофореза, определения количества белка радиоактивных антител в иммуносорбенте, иммуноферментного анализа.

К достоинствам РНГА следует отнести достаточно высокую воспроизводимость, простоту выполнения, потребность в минимальных количествах ингредиентов, особенно при использовании микрометода.

РНГА в последние годы нашла широкое применение при диагностике инфекционного ринотрахеита, диареи, аденовирусной инфекции, рота- и коронавирусной инфекции, парагриппа - 3 и респираторно – синцитиальной инфекции.

Приводим пример изготовления и применения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к рота- и коронавирусной инфекции.

Методика приготовления антительных диагностикумов для выявления рота- и коронавирусных антигенов в РНГА состоит в следующем: получение суспензии эритроцитов; фиксация их акролеинов; танизация, позволяющая получить стабильную сорбцию необходимого белка на эритроцитах; сенсибилизация танизированных эритроцитов иммуноглобулинами; определение специфичности приготовленного диагностикума. Приготовление суспензии эритроцитов осуществляется путем отбора крови клинически здорового барана в колбу со стеклянными бусами. После дефибринирования крови эритроциты должны быть отмыты 3-5 раз изотоническим (0,9%-ным) раствором натрия хлорида путем центрифугирования в течение 15-20 мин при 400g.

В целях стабилизации эритроцитов проводится их обработка акролеином. Как известно, его действие несколько мягче, чем формальдегида, и обеспечивает стабильность и более высокую активность эритроцитов. Для этого равные объемы 10%-ной взвеси эритроцитов смешивают с 0,2%-ным раствором акролеина, приготовленного на фосфатном буферном растворе (ФБР) с рН 7,2. Полученную суспензию выдерживают в течение 30 мин при 37°С, тщательно перемешивая, с последующим освобождением от акролеина многократным центрифугированием в течение 5 мин при 600-800g до полного исчезновения специфического запаха. Преимущество приготовленных таким образом эритроцитов заключается в том, что они заготавливаются впрок, могут длительное время сохраняться, не подвергаясь гемолизу.

В дальнейшем стабилизированные эритроциты в 10%-ной концентрации выдерживают при 2-4 °С в ФБР с рН 7,2 в течение двух месяцев.

Для повышения сорбционной способности и осаждаемости эритроцитов необходимо провести их танизацию путем смешивания равных частей 10%-ной суспензии отмытых эритроцитов и раствора танина на ФБР и рН 7,2 в разведении 1:30000. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 370 С в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от танина дважды в ФБР с рН 7,2 и трижды изотоническим раствором натрия хлорида с рН 7,2-7,4.

Оптимальным сроком гарантирующим получение качественных эритроцитарных диагностикумов является их сенсибилизация в течение 24- 48 часов после их обработки танином.

В процессе изготовления диагностикумов в качестве растворителя и консерванта используют 0,3%-ный фенолизированный изотонический раствор натрия хлорида с 0,1%-ной нормальной кроличьей или лошадиной сывороткой, предварительно инактивированной при 56°С в течение 30 мин и адсорбированной нормальными эритроцитами барана при 37°С в течение 30 мин.

Сенсибилизацию танизированных эритроцитов следует осуществлять гипериммунной сывороткой соответственно против рота- и коронавирусов крупного рогатого скота (производимой во Всероссийском НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко). При этом сенсибилизирующая доза (концентрация белка) антиротавирусной иммунной сыворотки составляет 280 мкг/мл, а иммунной сыворотки к коронавирусу -260 мкг/мл.

Сенсибилизацию проводят, смешивая равные объемы танизированных эритроцитов и предварительно прогретой в течение 30 мин при 560С иммунной сыворотки в оптимальной концентрации. Кроме того, вносят 3 части изотонического раствора натрия хлорида с рН 7,2 и 5 частей 0,1%-ного раствора хлорида хрома. Смесь, периодически помешивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. По истечении указанного времени смесь тщательно отмывают с использованием ФБР с рН 7,2, а затем приготовленные эритроцитарные диагностикумы ресуспендируют в консерванте до 1%-ной концентрации. Приготовленный диагностикум сохраняет свои основные качества в течение 8 мес., при условии хранения его при 4°С.

На всех этапах изготовления диагностикумов осуществляют контроль на самоагглютинацию. Специфичность приготовленных диагностикумов определяют путем постановки РНГА, где в качестве антигенов использовали стандартные диагностикумы вирусов ИРТ, ПГ - 3, аденовирусов, вирусной диареи, а также антигенов рота- и коронавирусов.

При постановке РНГА готовят последовательные двойные разведения исследуемого вируссодержащего материала (20-50%-ная суспензия проб фекалий), а затем в каждую лунку вносят равный объем эритроцитарного диагностикума. Плашки следует тщательно встряхнуть несколько раз, оставить при комнатной температуре до полного оседания эритроцитов в контроле. Показатель положительной реакции - агглютинация эритроцитарного диагностикума с интенсивностью агглютинации на 2+ в титре 1:4 и выше.