Reakcija se koristi za dijagnosticiranje sifilisa. Savremene metode za dijagnosticiranje sifilisa

Broj strana izdanja: 34-39

A.Yu.Mironov, Yu.B.Terehova

MMA im. I.M.Sechenova

Laboratorijska dijagnostika sifilisa
Sifilis je vrlo raznolik, karakterizira ga bogata paleta manifestnih i latentnih oblika, polisindromnih lezija, čije se prepoznavanje temelji na sveobuhvatnom kliničkom i laboratorijskom pregledu pacijenta.
Materijal za istraživanje pacijenata sa sifilisom je krv, iscjedak šankra i punktat regionalnih limfnih čvorova. Izbor materijala za istraživanje i mikrobiološku dijagnostičku metodu određen je stadijumom patogeneze bolesti.
Laboratorijska dijagnostika uključuje bakterioskopske (u početnoj fazi) i serološke metode. Bakteriološka istraživanja se obično ne provode, jer nisu razvijene dostupne metode za izolaciju čiste kulture patogena.
Zbog činjenice da je uzročnik sifilisa Treponema pallidum- za razliku od drugih mikroorganizama, slabo se uzgaja na hranjivim podlogama in vitro, a također slabo prihvaća anilinske boje; sve postojeće metode za njegovo otkrivanje mogu se podijeliti na direktne i indirektne.
Direktni testovi zasnovano na direktnom otkrivanju patogena u lezijama. To uključuje: mikroskopiju tamnog polja i RIT (test infektivnosti kunića) - infekcija materijalom od bolesnih zečeva. Indirektni testovi na osnovu detekcije antitijela na uzročnika sifilisa u krvnom serumu. To su serološka dijagnostika, kao i rijetko korištene histološke studije.
Svi trenutno postojeći serološki testovi na sifilis podijeljeni su u dvije glavne grupe:
. netreponemski [reakcija fiksacije komplementa sa kardiolipin Ag (CRCA), reakcija mikroprecipitacije (RMR), brzi plazma reagin test (RPR), laboratorija za istraživanje veneralnih bolesti (VDRL), test toluidin crvenog nezagrijanog seruma (TRUST)];
. treponem[reakcija fiksacije komplementa sa treponemskim Ag (RSKt), reakcija imobilizacije blijede treponema (RIBT ili RIT), reakcija imunofluorescencije (RIF) (u inostranstvu - FTA - Fluorescent Treponema l anibody) sa opcijama: RIF-200 (FTA-200), RIF-abs (FTA-abs), reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA) - u inostranstvu - Treponema pafluidum hemaglutinacijski test (TPHA), enzimski imunosorbentni test (ELISA) - u inostranstvu - enzimski imunosorbentni test (ELISA), imunobloting (Western blot)].
Pravo vizualizacija treponema pomoću mikroskopije tamnog polja je uvjerljiv dokaz o treponemskoj prirodi bolesti. Ova metoda je najefikasnija za primarni i sekundarni sifilis, prisustvo oštećenja kože i sluzokože. Kod mikroskopije je potrebno razlikovati T. pallidum, podvrsta pallidum, sa fibrinskim nitima, kao i sa treponemima normalne mikroflore ljudskog tijela - T. refringens i T. denticola. T. refringens kolonizira sluzokožu vanjskih genitalija i karakterizira je izražena pokretljivost i odsustvo fleksijskih pokreta. T. denticola kolonizira oralnu sluznicu, njezini su vijugavi kraći i usmjereni pod oštrijim uglom.
Mikroskopija tamnog polja ima osjetljivost od 74-86% i specifičnost do 97%, ovisno o vještini istraživača. Osjetljivost se može smanjiti ako je oštećenje obrisano antiseptikom. Međutim, negativan rezultat zbog različitih faktora nije osnov za isključenje dijagnoze sifilisa i zahtijeva daljnju potvrdu serološkim dijagnostičkim metodama. Osim toga, korištenjem ove metode nemoguće je pratiti dinamiku infektivnog procesa i procijeniti učinkovitost terapije.
Direktan test za T. pallidum sa fluorescentnim antitijelima (DFA-TP) koristi antitijela konjugirana s fluoresceinom za bojenje tijela u razmazima i dijelovima tkiva. DFA-TP ne zahtijeva pokretne organizme i osjetljiviji je i specifičniji, ali skuplji i tehnički izazovniji od mikroskopije tamnog polja. Na osjetljivost obje mikroskopske tehnike može negativno utjecati starost ili stanje ozljede, kao i da li je pacijent primio terapiju. Prema brojnim stranim autorima, direktne metode za određivanje T. pallidum To uključuje metode zasnovane na amplifikaciji nukleinske kiseline, kao što je PCR, koji može otkriti prisustvo samo 10 treponema u lezijama, tkivu placente i drugim tjelesnim tkivima. Oni su značajno poboljšali osjetljivost i specifičnost metoda direktne detekcije. Multipleksni PCR sa istovremenom detekcijom T. pallidum, herpes virus tip 2 i Haemophilis ducreyi koristi se za postavljanje etiološke dijagnoze kod pacijenata sa GUD (genitalnom ulkusnom bolešću), kao i za opravdavanje algoritama sindromskog liječenja. Budući da PCR tehnike za sifilis nisu komercijalno dostupne, one ostaju alat za istraživače. Biološka dijagnostička metoda, uprkos svojoj visokoj osjetljivosti, koristi se vrlo ograničeno zbog dužine vremena potrebnog za dobivanje rezultata i visoke cijene. Trenutno se praktično ne koristi. Danas vodeću ulogu u laboratorijskoj dijagnostici sifilisa imaju serološke metode istraživanja (naredba br. 87 od 26. marta 2001. Ministarstva zdravlja Ruske Federacije „O poboljšanju serološke dijagnoze sifilisa“), od T. pallidum generiše imune odgovore različitih tipova (slika 2).
Netreponemski testovi koriste antigen netreponemskog porijekla (obično antigen kardiolipin-lecitin-holesterol). Antitijela na fosfolipidne Ags na površini treponema unakrsno reagiraju sa Ags kardiolipina sisara. Tehnike flokulacije za detekciju ovih fosfolipidnih antitijela razvijene su kao nespecifični skrining testovi. To uključuje RMP i njegove modifikacije: RPR-, VDRL-, TRUST-test. Ovi testovi otkrivaju IgG i IgM antitela na lipide ćelijskog zida T. pallidum, koji se pojavljuju u krvi otprilike 1 tjedan nakon formiranja šankroida. Ovi testovi su jednostavni, brzi, jeftini i imaju odličnu osjetljivost, posebno u ranom periodu infekcije. Glavni nedostaci su nemogućnost korištenja pune krvi, potreba za rotatorom ili mikroskopom, te mogućnost lažno pozitivnih rezultata. Kod trudnica, do 28% pozitivnih rezultata RPR-a mogu biti biološki lažno pozitivni. Lažno negativni rezultati mogu se javiti sa viškom AT, što je poznato kao prozonski fenomen. Unakrsna reaktivnost se može javiti s drugim treponemskim infekcijama, uključujući smicanje i zvijanje.
Netreponemski testovi mogu biti kvalitativni ili semikvantitativni. Titri RPR i VDRL se povećavaju kod pacijenata s akutnom infekcijom, reinfekcijom ili reaktivacijom stare infekcije koja nije bila na zadovoljavajući način liječena. Oko 72-84% pacijenata sa primarnim ili sekundarnim sifilisom pokazuje 4-struko smanjenje titara RPR i VDRL 6 mjeseci nakon završetka odgovarajućeg liječenja. Stopa seroreverzije zavisi od titra prije tretmana i stadijuma bolesti. Pojedinci s prvom epizodom infekcije imaju veću vjerovatnoću da će doživjeti seroreverziju nego osobe s rekurentnom infekcijom. Stoga se netreponemski testovi koriste ne samo za određivanje aktivne infekcije, već i za praćenje efikasnosti liječenja (vidi sliku 2).
Treponemski testovi, kao što su RSKt, RIBT ili RIT, RIF (u inostranstvu - FTA i FTA-ABS), RPHA (TPHA ili TPPA), koriste se za potvrdu pozitivnih skrining testova, prepoznavanje lažno pozitivnih rezultata netreponemskih testova, u slučaju kliničke, epidemiološke i anamnestičke sumnje na sifilis, dijagnosticiranje latentnih oblika bolesti, postavljanje retrospektivne dijagnoze bolesnika. U treponemskim testovima koriste se antigeni treponemskog porijekla.
RIT i RIF imaju veću senzitivnost (74-94 i 84-99%) i specifičnost (99 odnosno 97%) i koriste se za potvrđivanje rezultata selekcijskih reakcija, prepoznavanje lažno pozitivnih rezultata RMP i RSC, kao i uspostaviti retrospektivnu dijagnozu sifilisa. Nedostaci ovih metoda su tehnička složenost, trajanje postupka, subjektivnost u ocjenjivanju rezultata, visoka cijena studije, te potreba za visokokvalifikovanim radnicima. Takođe treba uzeti u obzir da, prema brojnim autorima, kod približno 85% adekvatno liječenih pacijenata testovi na treponeme ostaju pozitivni nekoliko godina, pa čak i cijeli život, te se stoga ne mogu koristiti kao kontrola za izlječenje. Treponemski testovi su skupi, zahtijevaju opremu i tehničku obuku i dostupni su samo u centralnim laboratorijama.
Imunobloting je predložen kao alternativa FTA-ABS kao potvrdni test. Osetljiviji je od FTA-ABS, ali manje osetljiv od TPPA. Stopa lažno pozitivnih je nešto niža u treponemskim testovima nego u netreponemskim testovima. Treponemski testovi se obično ne koriste za skrining jer nisu toliko osjetljivi kao netreponemski testovi u prve 2-3 sedmice primarnog sifilisa. TreponemskiTreponemalni trbušnjaci često perzistiraju tokom života, što ove testove čini manje korisnim kao potvrdni testovi u područjima sa visokom prevalencijom bolesti; takođe nisu pogodni za praćenje efikasnosti lečenja.
Posljednjih godina u domaću praksu laboratorijske dijagnostike sifilisa uvedene su standardizirane visoko informativne metode serodijagnostike - ELISA i RPGA. Princip ELISA-e je da kombinuje AG-AT kompleks sa konjugatom koji sadrži enzimsku oznaku otkrivenu iz mešavine supstrata. RPGA se koristi za identifikaciju specifičnih antitijela na T. pallidum u krvnom serumu: sa kombinacijom AG T. pallidum sa specifičnim antitijelima u reakciji na mikroploči, uočava se fenomen aglutinacije eritrocita. Prednosti ovih metoda su u tome što su test sistemi za ELISA i RPGA sertifikovani i redovno nadgledani od strane relevantnih organizacija. Zbog jednostavnosti podešavanja, mogućnosti automatskog snimanja i brzine dobijanja rezultata pri proučavanju velikog broja uzoraka, ELISA i RPGA se mogu koristiti i kao skrining i kao potvrdne reakcije, jer su superiorne u osjetljivosti, specifičnosti i reproduktivnosti. CSR-u i nisu inferiorni u odnosu na RIT i RIF. Ali treba napomenuti da ELISA, kao i druge reakcije na sifilis, može dati i lažno pozitivne i lažno negativne rezultate. Prvi može nastati zbog reumatoidnog faktora, a to je ljudski IgG, zbog antitijela koja unakrsno reaguju sa antigenima treponeme, nastala u različitim sistemskim bolestima ili izazvana lijekovima, lijekovima, metaboličkim poremećajima; kod novorođenčadi - kroz stvaranje u tijelu fetusa ili djeteta IgM-AT do IgG majke, što značajno otežava tumačenje rezultata i dijagnozu kongenitalnog sifilisa. Lažno negativni rezultati reakcije su, uz tehničke greške, posljedica konkurencije između IgM i IgG, jer potonji imaju veći afinitet. Negativna strana RPGA je što se ovaj test ne može koristiti kao kriterij za izlječenje bolesti, jer je negacija takvih reakcija obično teška, štoviše, one mogu ostati pozitivne tijekom cijelog života.
Nažalost, sve metode serološke dijagnostike sifilisa zasnivaju se na indirektnom pokazatelju prisustva T. pallidum - AT odgovoru na Treponema pallidum u krvi pacijenata. To je dovelo do toga da do sada ne postoji jednoznačno objašnjenje uzroka serološke rezistencije i razlike u vremenu negativnosti kod pacijenata koji su primali istu vrstu liječenja, javljaju se problemi u postavljanju pouzdane dijagnoze kongenitalnog sifilisa, te kriteriji. za određivanje održivosti patogena sifilisa u domaćinu nisu razvijeni.
Nedostaci serodijagnostike sifilisa dali su poticaj razvoju molekularno genetskih metoda za dijagnosticiranje sifilisa, koje su postale široko rasprostranjene posljednjih godina. Patentirane metode za PCR dijagnostiku sifilisa (metoda za određivanje specifičnih sekvenci DNK T. pallidum koji se sastoji od amplifikacije DNK). Međutim, i pored niza prednosti PCR dijagnostike, ove metode imaju i značajne nedostatke, među kojima je potrebno istaći njihovu visoku cijenu, zbog visoke cijene prajmera za PCR dijagnostiku i visoke cijene laboratorijske opreme, što ograničava korištenje ovih metoda u laboratorijskoj praksi.
U tom smislu, razvoj modernih, jeftinih, visoko osjetljivih i specifičnih metoda za laboratorijsku dijagnostiku sifilisa je relevantan i od velikog značaja za medicinsku nauku i praktičnu zdravstvenu zaštitu.
Trenutno se razvijaju nove dijagnostičke metode zasnovane na identifikaciji molekularnih markera oštećenja organa kod sifilisa pomoću plinske hromatografije i masene spektrometrije (GC-MS). Uključivanje GC-MS metoda u arsenal laboratorijske dijagnostike sifilisa omogućava utvrđivanje prisutnosti T. pallidum u tijelu prisustvom specifičnog molekularnog markera. U skladu sa ovim istraživanjima, pokazalo se da se biohemijski sastav krvnog seruma bolesnika sa sifilisom razlikuje od seruma zdravih davalaca. Krvni serum bolesnika sa sifilisom sadrži komponente lipida, ugljikohidrata i aminokiselina koje mogu poslužiti kao molekularni markeri prisustva T. pallidum u tijelu (K.A. Osman, 2004). Takođe, GC-MS metodom su identifikovana hemijska jedinjenja koja su molekularni markeri oštećenja organa u ranim stadijumima bolesti. Prema istraživanju K.A. Osman (2004), takva jedinjenja u slučaju oštećenja centralnog nervnog sistema su D-galaktoza, D-trentol, glukoza i njen ciklični izomer - inozitol, u slučaju oštećenja jetre - aromatični derivati ​​masnih kiselina (fenilpropionska i feniloctena kiselina) , fragmenti aminokiselina, lipid-proteinski kompleks, u slučaju oštećenja kostiju - hlapljive masne kiseline, lipopolisaharidi i njihove podjedinice (C18-C20). Dakle, korištenje metoda plinske hromatografije i masene spektrometrije u dijagnostičkom arsenalu omogućava da se s visokim stupnjem pouzdanosti utvrdi prisutnost oštećenja organa i sustava u odsustvu pozitivnih seroloških reakcija i izraženih kliničkih manifestacija bolesti.

Reagin testovi se koriste za masovni skrining pacijenata na sifilis. Obično se provode u sklopu preventivnih pregleda. Ovakvi testovi su dostupni u svakoj zdravstvenoj ustanovi i brzo se izvode. Odgovor je obično gotov nakon 30-40 minuta.

Pozitivan rezultat tokom reaginskih reakcija nije kriterij za postavljanje dijagnoze. Potrebne su dodatne studije specifične za vrstu.

Najčešća metoda skrininga je Wassermanova reakcija. Koristi kardiolipin i treponemske antigene. Ako u krvnom serumu nema reagina, dolazi do hemolize crvenih krvnih zrnaca ovaca, koje se dodaju kao indikator.

U prisustvu reagina, cijela crvena krvna zrnca će precipitirati, u kom slučaju se reakcija smatra pozitivnom.

Reagin u sljedećim slučajevima:

• druge bolesti čiji su uzročnici po antigenskoj strukturi slični blijedoj spiroheti
• trudnoća
• onkološke bolesti
• uzimanje salicilata
• infarkt miokarda
• tehničke greške tokom analize

Ako je reakcija reagina pozitivna, provode se specifične serološke pretrage. Propisuju se i ako se sumnja na negativan rezultat.

Treponemski antigeni se koriste u testovima kao što su RIF, RIT, ELISA, RPGA, reakcija hemadsorpcije u čvrstoj fazi. Ove reakcije se zasnivaju na stvaranju kompleksa antigen-antitijelo i razlikuju se po načinu njihovog određivanja. Najčešće se koristi reakcija imunofluorescencije.

Lijek se tretira luminiscentnim serumom, što omogućava određivanje imunoloških kompleksa pod luminiscentnim mikroskopom.

Jedna od najosjetljivijih seroloških reakcija za dijagnosticiranje sifilisa je RPHA. Metoda je vrlo precizna. Često se koristi za provjeru dijagnoze tokom trudnoće, kada drugi testovi mogu dati lažno pozitivan rezultat.

Osobine serodijagnostike

Za serološka dijagnoza sifilisa u različitim razdobljima krv se vadi iz vene. Preporučuje se da se analiza obavi na prazan želudac, što smanjuje broj lažno pozitivnih rezultata. Epruveta mora biti sterilna. Prilikom izvođenja ekspresnih testova, u nekim slučajevima, krv se uzima iz prsta.

Ako se sumnja, uzima se cerebrospinalna tečnost za serodijagnostiku. Za njegovu analizu koriste se iste tehnike kao i za krvne pretrage.

Da biste dijagnosticirali sifilis, prođite kompletan pregled u našoj klinici.

Sifilis je zarazna bolest uzrokovana spirohetom Treponema pallidum, sklona progresivnom kroničnom toku, sa jasnom periodizacijom kliničkih simptoma.

Dominacija seksualnog prijenosa nad kontaktnim i transplacentarnim prijenosom ovu bolest svrstava među spolno prenosive bolesti (STD, SPI). Pored ovih metoda prijenosa infekcije, posebnu ulogu igra umjetni put (od latinskog "artificio" - umjetno stvoren).

Tipičan je za medicinske ustanove, uglavnom se sprovodi u bolničkom okruženju. Do infekcije dolazi prilikom transfuzije krvi, raznih hirurških operacija i invazivnih dijagnostičkih metoda.

Unatoč karantinu darovane krvi, problem identifikacije sifilisa kod donatora u različitim stadijumima bolesti i dalje je aktuelan.

Stoga dijagnostičke mjere za sifilis zahtijevaju standardizaciju, uvođenje novih osjetljivih i informativnih metoda identifikacije, kao i minimiziranje grešaka i pogrešne interpretacije rezultata testova.

Pokazi sve

1. Klasifikacija laboratorijskih dijagnostičkih metoda

Dijagnoza sifilisa ima neke karakteristike i razlikuje se od dijagnoze drugih bakterijskih infekcija. Složena struktura i antigena svojstva Treponema pallidum uzrokuju greške u interpretaciji rezultata seroloških reakcija.

Postoje 3 glavne grupe pacijenata kojima se nudi analiza krvi na sifilis:

1. 1 Skrining i medicinski pregled grupa stanovništva (uključujući trudnoću, prijavu u preporođajnu kliniku, zapošljavanje i registraciju zdravstvenog kartona, itd.).
2. 2 Skrining u rizičnim grupama (nezaštićeni seksualni odnos sa osobom zaraženom sifilisom, osobe nakon prisilnog seksualnog kontakta, osobe zaražene HIV-om itd.).
3. 3 Osobe sa simptomima bolesti ili osobe za koje se sumnja da imaju sifilitičnu infekciju.

Sve laboratorijske metode se konvencionalno dijele na direktne i indirektne.

1.1. Direktne metode

1. 1 Identifikacija Treponema pallidum u tamnom polju (mikroskopija tamnog polja).
2. 2 Infekcija eksperimentalnih životinja (uzgoj u laboratorijskim životinjama).
3. 3 PCR (lančana reakcija polimeraze).
4. 4 DNK sonda ili hibridizacija nukleinske kiseline.

1.2. Indirektne metode

Serološke reakcije su laboratorijske dijagnostičke metode zasnovane na detekciji antitijela (skraćeno AT) na antigene Treponema pallidum (skraćeno AG). Oni su od primarnog značaja za potvrđivanje dijagnoze.

1. 1 Netreponemski testovi:
   • Wassermanova reakcija (WRS);
   • Reakcija mikroprecipitacije (MR, RMP) i njeni analozi, koji su dati u nastavku;
   • Brzi plazma reagin test (RPR, RPR);
   • Test crvenog toluidina seruma (TRUST);
   • Netreponemski test Laboratorije za istraživanje veneričnih bolesti - VDRL.
2. 2 treponemska testa:
   • Treponema pallidum rastvor za imobilizaciju – RIBT/RIT;
   • Imunofluorescentni rastvor - RIF, FTA (razblaženja seruma RIF-10, RIF-200, RIF-abs);
   • R-cija pasivne hemaglutinacije (RPGA, TRPGA, TPHA);
   • Enzimski imunosorbentni test (ELISA, EIA);
   • Imunobloting.



Slika 1 – Algoritam za serodijagnostiku sifilisa

1.3. Histomorfološke metode

Ove metode se svode na utvrđivanje karakteristika histomorfologije sifilitičkih manifestacija. Pažnja se posvećuje suptilnostima strukture šankra. Međutim, diferencijalna dijagnoza infekcije pomoću histologije je vrlo teška. Histomorfologija se koristi s drugim laboratorijskim i kliničkim testovima.

2. Mikroskopija tamnog polja Treponema pallidum

Ova metoda se zasniva na direktnoj detekciji treponema pallidum u ispitivanom materijalu pomoću mikroskopa i posebnih uređaja (najčešće iscjedak iz erozija i čireva, rjeđe likvor i drugi supstrati).

Koristeći skarifikaciju, struganje, ceđenje, dobija se eksudat od erozija i ulceroznih defekata, a zatim se pripremljeni preparat pregleda pod mikroskopom.

Tipično, treponema pallidum se otkriva u preparatu dobijenom iz šankra, iz žarišta sekundarnog svježeg, sekundarnog rekurentnog sifilisa, kao i punktata limfnih čvorova i placente.

Zasnovana na fenomenu malih čestica koje svijetle u tamnom polju kada ih udari snop svjetlosti (Tyndallov fenomen), metoda savršeno omogućava razlikovanje uzročnika sifilisa od drugih treponema na osnovu morfoloških razlika i razlika u načinima kretanja bakterija.

Za mikroskopiju se koristi poseban kondenzator tamnog polja odgovarajuće optičke rezolucije. Lijek se dobiva metodom zgnječenih kapi (kap materijala se nanosi na čisto staklo bez masnoće i prekriva vrlo tankim pokrovnim stakalcem).

Ulje za potapanje se kapa na pokrivni stalak. Okretanjem cijevi i okretanjem uveličavajućeg sočiva podešava se željeno osvjetljenje.

U tamnom polju mikroskopa otkrivaju se krvne stanice, epitelne stanice i uzročnik sifilisa. Treponema pallidum izgleda kao spirala, vrlo tanak, emituje srebrnastu boju, glatkim pokretima.



Slika 2 – Mikroskopija tamnog polja kao način za vizualizaciju Treponema pallidum u materijalu koji se proučava. Izvor ilustracije - CDC

Treponema pallidum se mora razlikovati od drugih treponema, uključujući Tr. refringens, koji se može naći u orofarinksu i na sluznici genitalnih organa. Ova bakterija pravi haotične pokrete, ima široke i asimetrične, prilično grube kovrče. Osim toga, Treponema pallidum se razlikuje od Tr. Microdentium, Tr. Buccalis i Tr. vincenti.

Vizualizacija bakterija u tamnom polju ponekad je dopunjena reakcijom fluorescencije. U tu svrhu se nativni materijal dodaju antitreponemska antitijela označena fluorescentnom bojom. U tom slučaju nastaje kompleks antigen-antitijelo (skraćeno AG-AT) koji je predmet proučavanja pomoću fluorescentnog mikroskopa.

3. Metoda lančane reakcije polimeraze (PCR).

PCR, razvijen 1991. godine za otkrivanje molekula deoksiribonukleinske kiseline (DNK) Treponema pallidum, vrlo je osjetljiv i specifičan, omogućava otkrivanje fragmenata DNK patogena.

Ova analiza se zasniva na kopiranju kratkih delova DNK iz blijede spirohete, koja zadovoljava navedene parametre i prisutna je u uzorku. Sve ovo se izvodi u veštačkim uslovima (in vitro). Reakcija se odvija u uređaju - termičkom ciklusu, koji obezbeđuje periodizaciju temperaturnih ciklusa. Dolazi do hlađenja i zagrijavanja epruveta sa greškom od 0,1˚C.

DNK šablon se zagreva 2 minuta na temperaturi od 92-98˚C (maksimalna temperatura se koristi ako je polimeraza termostabilna). Kada se zagriju, lanci DNK se odvajaju zbog raspada vodikovih veza između njih. U koraku žarenja, temperatura reakcije se smanjuje kako bi se prajmer vezao za jednolančani šablon.

Žarenje traje oko 30 sekundi, a za to vrijeme se sintetišu stotine nukleotida. Novosintetizirani molekuli se kopiraju polimerazom, zbog čega se umnožavaju specifični fragmenti deoksiribonukleinske kiseline. Naknadna detekcija fragmenata provodi se elektroforezom u agar gelu.

PCR dijagnoza sifilisa je i dalje eksperimentalne prirode, ali je opravdana pri otkrivanju kongenitalne infekcije, u složenim dijagnostičkim slučajevima ili kada je sadržaj Treponema pallidum minimalan u ispitivanom materijalu.

4. DNK hibridizacija

Hibridizacija DNK se izvodi in vitro i zasniva se na potpunom ili djelomičnom spajanju dva jednolančana DNK molekula u jedan molekul. U slučaju potpune korespondencije komplementarnih fragmenata, spajanje se odvija lako. Ako je komplementarno poklapanje djelomično, tada se spajanje lanaca DNK odvija sporo. Na osnovu vremena fuzije lanca može se procijeniti stepen komplementarnosti.

Kada se DNK zagrije u puferskom rastvoru, vodonične veze se prekidaju azotnim bazama koje su komplementarne, što uzrokuje divergaciju lanaca DNK. Zatim se lijek dobiva iz dvije denaturirane deoksiribonukleinske kiseline. Kada se ohlade, jednolančani regioni postaju renaturisani. Formira se takozvani DNK hibrid.

Metoda vam omogućava da procijenite i analizirate brzinu žarenja, uzimajući u obzir karakteristike (sličnosti i razlike) DNK između vrsta ili unutar vrste.

Upotreba DNK sonde uključuje hibridizaciju označenog DNK fragmenta sa specifičnim DNK regionom da bi se identifikovale komplementarne nukleotidne sekvence. Grupa nezasićenih atoma (hromofora) ili radioaktivnih izotopa koristi se za označavanje sonde.

DNK sonda se koristi za heterogenu i homogenu detekciju nukleinskih kiselina. Uloga sonde je da identifikuje područja u kojima je došlo do fuzije ciljne sonde. Detekcija u homogenom sistemu ima prednost jer omogućava praćenje hibridizacije molekula DNK u realnom vremenu.

Suština metode je denaturacija i renaturacija DNK (ponovno ujedinjenje lanaca DNK). Proces renaturacije nukleinske kiseline i DNK sonde završava se formiranjem “hibrida”.

Specifične sekvence nukleinskih kiselina hibridizuju sa DNK sondom i na taj način se detektuju i omogućavaju da se proceni količina DNK u materijalu koji se proučava.

5. Infekcija laboratorijskih životinja

Visoka osjetljivost zečeva na Treponema pallidum (oko 99,9%) omogućava im da se koriste u dijagnostici sifilitičke infekcije.

Infekcija kunića se provodi u istraživačkim centrima i predstavlja „zlatni standard“ za procjenu osjetljivosti drugih metoda.

Vratimo se treponemskim i netreponemskim testovima, jer se oni najčešće koriste. Razmotrimo njihove prednosti i nedostatke, kao i greške u tumačenju rezultata.

6. Netreponemski testovi

Ovo su testovi za određivanje IgG i IgM antitela na standardizovani kardiolipin antigen. Njihov značajan nedostatak je njihova relativno niska specifičnost.

Niska cijena i lakoća implementacije omogućavaju da se ovi testovi klasificiraju kao dijagnostički testovi neophodni za postavljanje preliminarne dijagnoze i skrining među populacijom.

Radi se o netreponemskim testovima koji se rade prilikom prijave za zdravstveni karton, prijave za posao ili prijave u antenatalnu ambulantu.

Nedostaci:

1. 1 Minimalna osjetljivost u stadijumu primarnog sifilisa – 70%;
2. 2 Minimalna osetljivost u stadijumu kasnog sifilisa – 30%;
3. 3 Mogućnost lažno negativnih i lažno pozitivnih rezultata;
4. 4 Intenzitet rada izvođenja RSK.

Prednosti:

1. 1 Relativno niska cijena testne proizvodnje;
2. 2 Primite brzi odgovor;
3. 3 Mogućnost njihove upotrebe za skrining.

Dobivanje lažno pozitivnih ili slabo pozitivnih uzoraka moguće je u sljedećim slučajevima:

1. 1 Kršenje tehnologije izvršenja prilikom blokiranja AG-AT kompleksa.
2. 2 Pacijent ima autoimune bolesti (reumatoidni artritis, reumatizam, skleroderma, sistemski eritematozni lupus, sarkoidoza itd.).
3. 3 Maligne neoplazme.
4. 4 Virusne i bakterijske infekcije.
5. 5 Endokrine bolesti (autoimuni tiroiditis, dijabetes melitus).
6. 6 Trudnoća.
7. 7 Konzumiranje alkohola.
8. 8 Konzumiranje masne hrane.
9. 9 Senilna dob.

Kao što možete vidjeti iz liste, postoji mnogo razloga za netačan rezultat. Stoga treba biti veoma oprezan prema tome. Razmotrimo još dva uzorka uz RSC. Ovo je reakcija mikroprecipitacije i VDLR (njena modifikacija).

7. Reakcija fiksacije komplementa (RSK, Wasserman, RW)

Ovo je test zasnovan na sposobnosti komplementa da se veže za AG-AT komplekse. Formirani kompleks se identifikuje pomoću hemolitičkog sistema. Kardiolipin antigen značajno povećava osjetljivost testa.

Osetljiva je i Kolmerova reakcija, koja se sastoji od izvođenja pri različitim temperaturnim uslovima. Dakle, prva faza Kolmerove reakcije teče na temperaturi od 20˚C pola sata, druga faza na temperaturi od 4-8˚C 20 sati. Za to vrijeme dolazi do fiksacije komplementa.

Prilikom izvođenja RSC-a moguće je dobiti dramatično pozitivne rezultate. Razlog je vjerovatno visok titar antitijela u nerazrijeđenom serumu. U ovom slučaju, uzorci se daju sa opadajućim dozama.

Da bi se razlikovali stadijumi sifilisa i procenila efikasnost antisifilitičkog tretmana, određuje se količina AT u serumu.

Pozitivnost uzorka se procjenjuje pomoću ukrštanja, a razrjeđenje seruma je također indicirano u Wasserman, Kolmer i Kann reakcijama.

8. Reakcija mikroprecipitacije

Budući da je složenost izvođenja navedenih pretraga velika, razvijena je ubrzana metoda za serodijagnostiku sifilisa, tzv. ekspresna metoda - reakcija mikroprecipitacije (skraćeno MR, RMP), koja pokriva širinu kliničkog pregleda različitih grupa stanovništva. .

Izvodi se s kardiolipinskim antigenom i pomoćnim supstancama. Njegova prednost je uzimanje periferne krvi za istraživanje. Time se značajno ubrzava i sama tehnika i rad laboratorijskih tehničara.



Slika 2 - Reakcija mikroprecipitacije (šema)

Za izvođenje MR potrebna je plazma ili inaktivirani serum krvi pacijenta (sadrže antitijela). Zatim se plazma stavlja u označene jažice. Zatim se testnom materijalu doda kap kardiolipin antigena, promiješa se i promućka. Kao rezultat toga, u serumu zaražene osobe pojavljuju se karakteristične pahuljice, različitog intenziteta.

Ovo je kvalitetan uzorak. Za kvantitativnu procjenu koristi se 10 razblaženja seruma, stavljenih u 10 jažica sa odgovarajućim oznakama. Kod kvalitativnog MR-a, odgovor je naznačen u obliku krstova (plusova) ili minusa, a kod kvantitativnog MR-a je naznačen titar antitela (1:2, 1:4 i tako dalje).

Prisustvo pahuljica smatra se pozitivnim ili slabo pozitivnim odgovorom. Pojava flokulata je moguća i u odsustvu bolesti, pa se konačna procjena dobijenog rezultata vrši nakon kontrolne studije ili drugih reakcija (RIBT, RIF, ELISA, RPGA).

9. VDRL

Metoda koju preporučuje Svjetska zdravstvena organizacija za insceniranje reakcije s lipoidnim antigenom (AG) s pravom se smatra najboljom među ostalim standardnim netreponemskim testovima. Razvijen u SAD-u, Georgia u laboratoriji za polno prenosive bolesti (Venereal Diseases Research Laboratories).

Skraćenica institucije poslužila je kao naziv za uzorak - VDRL. VDRL je modifikacija MR. Serum bolesnika sa sifilisom se inaktivira i stavlja na staklo. Korišteni antigen sastoji se od kardiolipina, holesterola i lecitina u različitim procentima. Odgovor se registruje skoro odmah.

Izrazita flokulacija se javlja u prisustvu antitijela u serumu. Serum postaje reaktivan nakon 4 sedmice infekcije. Da bi se procijenila količina antitijela, serum se prethodno razrijedi eksponencijalno.

Prednosti VDRL-a:

1. 1 relativno visoka osjetljivost;
2. 2 relativno visoka specifičnost;
3. 3 lakoća izvođenja;
4. 4 niska cijena reagensa;
5. 5 dobijam brz odgovor.

Nedostatak VDRL-a je njegova relativno visoka stopa lažno pozitivnih rezultata.

Njihovi uzroci su iste gore navedene bolesti.

Treponemski testovi se izvode sa specifičnim antigenima Treponema pallidum. Oni su neophodni i obavezni za postavljanje konačne dijagnoze. To su reakcija imunofluorescencije (RIF), reakcija indirektne hemaglutinacije (IPHA), enzimski imunosorbentni test (ELISA) itd.

Nakon pozitivnog rezultata netreponemskog testa (RPR, MP, VDRL), uvijek treba uraditi treponemske testove (obično kombinacija - RPHA, ELISA, RIF).

Treponemski testovi su složeniji za izvođenje od brzih testova i zahtijevaju više novca.

10. RIF

Ova reakcija (skraćeno RIF) koristi se za dijagnosticiranje sifilisa, uključujući latentne oblike, i za dvostruku provjeru pozitivnih i lažno pozitivnih uzoraka.

RIF se zasniva na sjaju obeleženih antitela kada se kombinuje sa kompleksom antigen-antitelo pod kvarcnom lampom. Metoda se počela koristiti 60-ih godina i odlikovala se jednostavnošću implementacije i visokom specifičnošću (koja je malo inferiorna u odnosu na RIBT).

Ima nekoliko modifikacija: RIF-10, RIF-200 i RIF-abs.

RIF je najosetljiviji kada se razblaži 10 puta, a ostali su specifičniji. RIF se izvodi u dvije faze. Krvni serum pacijenta se dodaje u AG. Formira se AG-AT kompleks koji se proučava u sljedećoj fazi. Zatim se mikroskopski identifikuje kompleks obeležen fluorohromom. Ako se ne uoči sjaj, to ukazuje na odsustvo specifičnih antitijela u krvnom serumu.

RIF-200 je najvredniji od svih razblaženja. Metoda je namijenjena dijagnosticiranju različitih oblika sifilisa, posebno latentnog sifilisa i ponovnoj provjeri pozitivnih uzoraka.

11. RIBT

Reakcija imobilizacije Treponema pallidum (skraćeno RIBT, RIT) je jedan od složenih seroloških testova koji zahtijeva značajne napore i finansijske troškove. RIBT se sve manje koristi, ali njegova važnost ostaje u dijagnostici latentnog sifilisa.

Od velikog je značaja u prepoznavanju lažno pozitivnih rezultata kod trudnica i zasniva se na imobilizaciji bakterija u prisustvu imobilizina – kasnih antitijela.

Rezultat se procjenjuje na osnovu procenta (%) imobiliziranih treponema pomoću posebne tablice:

1. 1 Od 0 do 20 - negativan test.
2. 2 Od 21 do 50 - slabo pozitivan test.
3. 3 Od 50 do 100 - pozitivna reakcija.

Lažno pozitivni rezultati su takođe mogući kada se koristi RIBT. Dakle, netačan odgovor je moguć pri infekciji tropskim trepanematazama, kao i kod tuberkuloze, ciroze jetre, sarkoidoze i starijih pacijenata.

12. RPGA

Ovaj test krvi za sifilis naziva se test pasivne hemaglutinacije (skraćeno kao test krvi za RPHA, THRHA).

Antigen za RPHA se priprema od crvenih krvnih zrnaca ovaca obloženih fragmentima Treponema pallidum (dobijenih od zaraženih zečeva (vidi sliku 4)). U analizi se koristi venska krv (plazma ili inaktivirani serum) pacijenta.

Kada se antigen doda u serum bolesnika sa sifilisom, formira se AG-AT kompleks koji dovodi do aglutinacije crvenih krvnih stanica. aglutinaciju subjektivno određuje laboratorijski tehničar.



Slika 3 - Šema RPHA (reakcija pasivne hemaglutinacije)

Uzorak se ocjenjuje kao pozitivan kada se pojave aglutinate ujednačene ružičaste boje. Crveno bojenje taloga ukazuje na precipitaciju crvenih krvnih zrnaca. RPHA je vrlo osjetljiv i vrlo specifičan.

12.1. Reakcija mikrohemaglutinacije

To je pojednostavljena verzija RPGA. Razlikuje se od gore opisanog testa po tome što je potrebno manje antigena, razblaživača i seruma za izvođenje reakcije. 4 sata nakon inkubacije seruma, uzorak se može procijeniti. Koristi se za skrining i masovne preglede na sifilis.

13. Enzimski imunotest

Enzimski imunosorbentni test (skraćeno ELISA) zasniva se na specifičnoj reakciji antigen-antitijelo. Biološki materijal (krvni serum pacijenta, likvor) se unosi u jažice na čijoj su čvrstoj površini fiksirani antigeni treponema pallidum. Ispitni materijal se inkubira, a zatim se ispiru antitela koja se nisu vezala za antigene (vidi sliku 5).

Identifikacija nastalog kompleksa se provodi u fazi fermentacije pomoću imunološkog seruma označenog enzimom. Tokom hemijske reakcije, enzim boji nastale komplekse. Intenzitet bojenja ovisi o količini specifičnih antitijela u krvi pacijenta i bilježi se spektrofotometrom.



Slika 4 - Šema ELISA (enzimski imunosorbentni test)

Osetljivost ELISA je veća od 95%. Metoda se koristi u automatizovanom režimu za proučavanje elektivnih populacijskih grupa: donora, trudnica i drugih, radi pojašnjenja dijagnoze pozitivnih i lažno pozitivnih netreponemskih testova.

14. Imunobloting

Imunobloting je visoko osjetljiva metoda, modifikacija jednostavne ELISA. Reakcija se zasniva na elektroforezi sa odvajanjem antigena Treponema pallidum.

Odvojene imunodeterminante se prenose na nitrocelulozni papir i razvijaju u ELISA testu. Zatim se serum inkubira i nevezana antitijela se ispiru. Dobijeni materijal se tretira imunoglobulinima (IgM ili IgG) označenim enzimom.

15. Klinička procjena rezultata laboratorijske dijagnostike sifilisa

U tabeli 1 ispod dali smo moguće rezultate testova i njihovu interpretaciju. Kao što možete vidjeti u tabeli, sveobuhvatna procjena testova je od primarne važnosti prilikom dešifriranja.



Tabela 1 - Tumačenje rezultata seroloških reakcija (testovi krvi na sifilis). Za pregled kliknite na tabelu

Reaktivnost testa se također procjenjuje korištenjem "križeva":

1. 1 Maksimalni odgovor (naglo pozitivan test) označen je sa 4 križa.
2. 2 Pozitivan test je označen sa 3 krsta.
3. 3 Slabo pozitivnu reakciju označavaju dva križa.
4. 4 Jedan križić označava sumnjiv i negativan rezultat.
5. 5 Negativan odgovor je označen znakom minus.

Problem optimizacije laboratorijske dijagnostike sifilisa do danas nije izgubio na važnosti. Savremene dijagnostičke metode, uprkos želji naučnika da dijagnostiku dovedu do što većeg stepena osetljivosti i specifičnosti, zahtevaju kontrolna ispitivanja i individualni pristup.

Karakteristika sifilitičke infekcije je fenomen serorezistencije, koji nikada nije dobio naučno objašnjenje. Dijagnoza se postavlja nakon potpunog pregleda pacijenta epidemiološkim, kliničkim i laboratorijskim metodama.

U kontekstu ekonomskog i tehničkog razvoja medicine, primjećuje se i napredak u razvoju novih kriterija za dijagnosticiranje sifilisa. Sve to će Vam omogućiti da brzo, uspješno i precizno liječite pacijente.

U slučaju primarnog sifilisa, šankroidni iscjedak ili punktatni limfni čvorovi se pregledaju na treponema pallidum. U slučaju sekundarnog sifilisa, materijal se uzima sa površine erodiranih papula na koži, sluzokože, pukotina i sl. Prije uzimanja materijala radi čišćenja od raznih kontaminanata, površine lezija (erozije, čirevi, pukotine) ) potrebno je temeljito obrisati sterilnim štapićem od pamučne gaze, koji je navlažen izotoničnom otopinom natrijevog hlorida ili prepisati losione sa istim rastvorom. Očišćena površina se osuši suvim štapićem i platinastom omčom ili lopaticom blago iritira periferne delove, dok se istovremeno u gumenoj rukavici lagano stišće podnožje elementa dok se ne pojavi tkivna tečnost (serum), od kojih se priprema priprema za istraživanje. Pribavljanje tkivne tečnosti je važno za dijagnostikovanje sifilisa, jer se treponema pallidums nalazi u lumenima limfnih kapilara, u pukotinama tkiva oko limfnih i krvnih sudova.

Punkcija regionalnih limfnih čvorova

Koža iznad limfnih čvorova tretira se 96% alkohola i 3-5% alkoholnog rastvora joda. Zatim 1. i 2. prstom lijeve ruke popravite limfni čvor. Desnom rukom uzmite sterilnu špricu s nekoliko kapi izotonične otopine natrijum hlorida, koja se ubrizgava paralelno sa uzdužnom osi limfnog čvora. Igla se gura u različitim smjerovima do suprotnog zida kapsule čvora i sadržaj šprica se polako ubrizgava. Prstima lijeve ruke lagano se masira limfni čvor. Kada se igla polako izvlači, istovremeno se izvlači klip šprica, aspirirajući sadržaj limfnog čvora. Materijal se nanosi na predmetno staklo (ako je količina materijala mala, dodaje se kap izotonične otopine natrijum hlorida) i prekriva se pokrovnim stakalcem. Proučavanje nativnog lijeka provodi se u tamnom vidnom polju pomoću svjetlosno-optičkog mikroskopa sa kondenzatorom tamnog polja (40, 7x, 10x ili 15x objektiv). Treponema pallidum se takođe može naći u preparatima u boji. Kada se boje prema Romanovsky-Giemsi, blijede treponeme su obojene ružičasto, prema Fontanu i Morozovu - smeđe (crne), prema Burri metodi, neobojena treponema se otkriva na tamnoj pozadini.

Serološka dijagnoza

Standardne (klasične) i specifične serološke reakcije su od velikog značaja u dijagnostici sifilisa, proceni efikasnosti lečenja, utvrđivanju kriterijuma izlečenja i identifikaciji latentnih, rezistentnih oblika. Standardne ili klasične serološke reakcije (SSR) uključuju:

• Wassermanova reakcija (WR),
• sedimentne reakcije Kahna i Sachs-Vitebskog (citoholne),
• reakcija na staklu (ekspresna metoda),

na konkretno:

• treponema pallidum reakcija imobilizacije (treponema pallidum reakcija),
• imunofluorescentna reakcija (RIF).

Wassermanova reakcija (WR)

- razvio A. Wasserman zajedno sa A. Neisserom i C. Bruckom 1906. godine. Wassermanova reakcija se zasniva na fenomenu fiksacije komplementa (Bordet-Gengou reakcija) i omogućava određivanje antilipidnih antitijela (reagina). Prema modernim konceptima, Wassermanova reakcija otkriva antitijela na lipide makroorganizma, a ne Treponema pallidum, a reakcija otkriva autoimuni proces koji je uzrokovan denaturacijom tkiva makroorganizma Treponema pallidum sa stvaranjem lipoproteinskog kompleksa ( konjugat), u kojem su lipidi (hapteni) determinanta.

RV se obično dijagnosticira sa dva ili tri antigena. Najčešće korišteni su visoko osjetljivi kardiolipin antigen (ekstrakt goveđeg srca obogaćen kolesterolom i lecitinom) i treponemski antigen (sonicirana suspenzija anatogenih kultiviranih treponemes pallidum). Zajedno sa serumskim reaginima pacijenta, ovi antigeni formiraju imuni kompleks sposoban da adsorbuje i veže komplement. Za vizualno određivanje formiranog kompleksa (reagini + antigen + komplement), kao indikator se koristi hemolitički sistem (mješavina ovčijih eritrocita sa hemolitičkim serumom). Ako je komplement vezan u fazi 1 reakcije (reagini + antigen + komplement), hemoliza ne nastaje - crvena krvna zrnca precipitiraju u lako uočljiv precipitat (PB pozitivan). Ako u fazi 1 komplement nije vezan zbog odsustva reagina u test serumu, koristit će ga hemolitički sistem i doći će do hemolize (RT negativan). Stepen ozbiljnosti hemolize pri postavljanju RV ocjenjuje se plusovima: potpuno odsustvo hemolize ++++ ili 4+ (RV je oštro pozitivan); jedva započeta hemoliza +++ ili 3+ (RV pozitivan); značajna hemoliza ++ ili 2+ (RV slabo pozitivan); nejasna slika hemolize ± (RV je sumnjiv); potpuna hemoliza - (negativna Wassermannova reakcija).

Pored kvalitativne procjene PB, postoji i kvantitativna procjena s različitim razrjeđenjima seruma (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titar reagina je određen maksimalnim razrjeđenjem koje još uvijek daje oštro pozitivan (4+) rezultat. Kvantitativno stadijum RV je važan u dijagnostici nekih kliničkih oblika sifilitičke infekcije, kao i u praćenju efikasnosti lečenja. Trenutno se Wassermanova reakcija izvodi sa dva antigena (kardiolipin i treponemski glasni Reiter soj). U pravilu, RV postaje pozitivna 5-6 sedmica nakon infekcije kod 25-60% pacijenata, 7-8 sedmica - 75-96%, 9-19 sedmica - 100%, iako posljednjih godina ponekad i ranije ili kasnije. Istovremeno, titar reagina se postepeno povećava i dostiže maksimalnu vrijednost (1:160-1:320 i više) u slučaju generaliziranih osipa (sekundarni svježi sifilis). Kada je RV pozitivan, postavlja se dijagnoza primarnog seropozitivnog sifilisa.
Sa sekundarnim svježim i sekundarnog rekurentnog sifilisa, RV je pozitivan kod 100% pacijenata, ali kod osiromašenih pacijenata sa oslabljenim imunitetom može se uočiti negativan rezultat. Potom se titar reagina postepeno smanjuje i u slučaju sekundarnog rekurentnog sifilisa obično ne prelazi 1:80-1:120.
Za tercijarni sifilis RV je pozitivan kod 65-70% pacijenata i obično se opaža nizak titar reagina (1:20-1:40). Kod kasnih oblika sifilisa (sifilis unutrašnjih organa, nervnog sistema) pozitivan RV se uočava u 50-80% slučajeva. Titar reagina se kreće od 1:5 do 1:320.
Za latentni sifilis pozitivan RV je uočen kod 100% pacijenata. Titar reagina je od 1:80 do 1:640, a kod kasnog latentnog sifilisa od 1:10 do 1:20. Brzo smanjenje titra reagina (do potpune negativnosti) tokom liječenja ukazuje na učinkovitost liječenja.

Nedostaci Wassermanove reakcije- nedovoljna osjetljivost (negativna u početnoj fazi primarnog sifilisa). Negativan je i kod 1/3 pacijenata ako su u prošlosti liječeni antibioticima, kod pacijenata sa tercijarnim aktivnim sifilisom sa lezijama kože i sluzokože, osteoartikularnog aparata, unutrašnjih organa, centralnog nervnog sistema i sa kasnim kongenitalnim sifilis.
Nedostatak specifičnosti- Wassermanova reakcija može biti pozitivna kod osoba koje ranije nisu imale i nemaju sifilis. Konkretno, lažno pozitivni (nespecifični) rezultati RV uočeni su kod pacijenata koji boluju od sistemskog eritematoznog lupusa, lepre, malarije, malignih neoplazmi, oštećenja jetre, opsežnog infarkta miokarda i drugih bolesti, a ponekad i kod potpuno zdravih osoba.
Otkrivena je kratkotrajna lažno pozitivna Wassermanova reakcija kod nekih žena prije ili poslije porođaja, kod narkomana, nakon anestezije ili pijenja alkohola. Po pravilu, lažno pozitivna RV je slabo izražena, često sa niskim titrom reagina (1:5-1:20), pozitivnim (3+) ili slabo pozitivnim (2+). Tokom masovnih seroloških pregleda, učestalost lažno pozitivnih rezultata je 0,1-0,15%. Za prevazilaženje nedovoljne osjetljivosti koriste se hladni test (Kolyar reakcija) i istovremeno se radi sa drugim serološkim reakcijama.

Sedimentne reakcije Kahna i Sachs-Vitebskog

Wassermanova reakcija se koristi u kombinaciji s dvije sedimentne reakcije (Kahn i Sachs-Vitebsky), kada se stadiju, pripremaju se koncentrisaniji antigeni. Ekspresna metoda (mikroreakcija na staklu) - odnosi se na lipidne reakcije i zasniva se na reakciji taloženja. Stavlja se sa specifičnim kardiolipinskim antigenom, čija se 1 kap pomiješa sa 2-3 kapi testnog krvnog seruma u jažice posebne staklene ploče.
Prednost- brzina prijema odgovora (za 30-40 minuta). Rezultati se procjenjuju količinom taloženog sedimenta i veličinom pahuljica. Ekspresivnost se definiše kao CSR - 4+, 3+, 2+ i negativna. Treba napomenuti da se lažno pozitivni rezultati uočavaju češće nego kod RV. Ekspresna metoda se u pravilu koristi za masovne preglede na sifilis, za preglede u kliničko-dijagnostičkim laboratorijama, somatskim odjelima i bolnicama. Na osnovu rezultata ekspresne metode, zabranjena je dijagnoza sifilisa, isključena je njegova upotreba kod trudnica, donora, kao i za kontrolu nakon liječenja.

Treponema pallidum reakcija imobilizacije (TPI)

Treponema pallidum reakcija imobilizacije (TPI)- predložili su 1949. R. W. Nelson i M. Mayer. To je najspecifičniji dijagnostički test za sifilis. Međutim, složenost i visoka cijena proizvodnje ograničavaju njegovu upotrebu. U krvnom serumu pacijenata određuju se video-specifična antitijela (imobilizini) koja dovode do nepokretnosti Treponema pallidum u prisustvu komplementa. Antigen je živa patogena Treponema pallidum izolovana od zečeva zaraženih sifilisom. Pod mikroskopom se prebrojava izgubljena pokretljivost (imobilizirana) Treponema pallidum i procjenjuju se rezultati RIBT: imobilizacija Treponema pallidum od 51 do 100% je pozitivna; od 31 do 50% - slabo pozitivno; od 21 do 30% - sumnjivo; od 0 do 20% - negativno.
RIBT je važan u diferencijalnoj dijagnozi za razlikovanje lažno pozitivnih seroloških reakcija od reakcija uzrokovanih sifilisom. Kasno postaje pozitivno od RV, RIF i samim tim ne koristi se za dijagnosticiranje infektivnih oblika sifilisa, iako je u sekundarnom periodu sifilisa pozitivan kod 85-100% bolesnika.
U tercijarnom periodu sifilisa sa oštećenjem unutrašnjih organa, mišićno-koštanog sistema i nervnog sistema, RIBT je pozitivan u 98-100% slučajeva ( RV je često negativan).
Treba imati na umu da RIBT može biti lažno pozitivan ako test serum sadrži treponemocidne lijekove (penicilin, tetraciklin, makroliti, itd.), koji uzrokuju nespecifičnu imobilizaciju Treponema pallidum. U tu svrhu, krv se testira na RIBT ne ranije od 2 sedmice nakon prestanka uzimanja antibiotika i drugih lijekova.
RIBT se, kao i RIF, polako negativan tokom procesa liječenja, tako da se ne koristi kao kontrola tokom procesa liječenja.

Imunofluorescentna reakcija (RIF)

Imunofluorescentna reakcija (RIF)- razvijen 1954. od strane A.Coonsa i prvi put korišten za dijagnozu sifilitičke infekcije od strane Deacona, Falconea, Harrisa 1957. godine. RIF se zasniva na indirektnoj metodi za određivanje fluorescentnih antitijela. Antigen za proizvodnju je tkivno patogena Treponema pallidum fiksirana na staklenim predmetima, na koje se nanosi test serum. Ako test serum sadrži anti-treponemska antitijela povezana s IgM i IgG, ona se snažno vezuju za antigen - treponemu, što se detektuje u fluorescentnom mikroskopu korištenjem anti-species ("anti-humanog") fluorescentnog seruma.
RIF rezultati uzimaju se u obzir intenzitetom sjaja blijede treponeme u preparatu (žuto-zeleni sjaj). U nedostatku antitreponemskih antitijela u serumu, treponema pallidum se ne otkriva. U prisustvu antitijela, otkriva se sjaj blijede treponeme, čiji je stupanj izražen u plusu: 0 i 1+ - negativna reakcija; od 2+ do 4+ - pozitivno.
RIF se odnosi na grupne treponemske reakcije i primjenjuje se u 10- i 200-strukom razrjeđenju test seruma (RIF-10 i RIF-200). RIF-10 se smatra osjetljivijim, ali se često dobijaju nespecifični pozitivni rezultati nego sa RIF-200 (ima veću specifičnost). obično, RIF postaje pozitivan ranije od RV- pozitivan kod primarnog seronegativnog sifilisa kod 80% bolesnika, u 100% u sekundarnom periodu sifilisa, uvijek pozitivan kod latentnog sifilisa i u 95-100% slučajeva kod kasnih oblika i kongenitalnog sifilisa.
Specifičnost RIF-a povećava se nakon prethodnog tretmana test seruma sorbent-ultrazvučnim treponemskim antigenom, koji veže grupna antitijela (RIF - abs).
Indikacije za RIBT i RIF- dijagnoza latentnog sifilisa za potvrdu specifičnosti kompleksa lipidnih reakcija u slučaju sumnje na sifilitičnu infekciju na osnovu pozitivnog RV. Pozitivni RIBT i RIF dokaz su latentnog sifilisa. U slučaju lažno pozitivnih RV kod različitih bolesti (sistemski eritematozni lupus, maligne neoplazme itd.) i ako su ponovljeni rezultati RIBT i RIF negativni, to ukazuje na nespecifičnu prirodu RV. Sumnja na kasne sifilitičke lezije unutrašnjih organa, mišićno-koštanog sistema, nervnog sistema ako pacijenti imaju negativan RV. Sumnja na primarni seronegativni sifilis, kada se kod pacijenata s ponovljenim studijama iscjedaka s površine erozije (čira), punkcija iz uvećanih regionalnih limfnih čvorova, treponema pallidum ne otkrije - u ovom slučaju se daje samo RIF - 10.
Prilikom pregleda osoba sa negativnim RV koji su imali dugotrajne seksualne i kućne kontakte sa pacijentima sa sifilisom, uzimajući u obzir vjerovatnu mogućnost njihovog liječenja u nedavnoj prošlosti antisifiliticima koji su uzrokovali RV negativnost. Enzimski imunosorbentni test (ELISA - enzimski imunosorbentni test) - metoda koju su razvili E. Engvall et al., S. Avrames (1971). Suština se sastoji u kombiniranju sifilitičkog antigena sorbiranog na površini nosača čvrste faze s antitijelom iz krvnog seruma koji se proučava i identifikaciji specifičnog kompleksa antigen-antitijelo korištenjem enzimom označenog anti-species imunološkog krvnog seruma. Ovo vam omogućava da vizuelno procenite rezultate ELISA-e prema stepenu promene boje supstrata pod dejstvom enzima uključenog u konjugat. Nepouzdani rezultati ELISA mogu nastati kao rezultat nedovoljnog razblaženja sastojaka, kršenja temperaturnih i vremenskih uslova, nekonzistentnosti pH rastvora, kontaminacije laboratorijskog staklenog posuđa i nepravilne tehnike ispiranja medija.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA)

Predloženo kao dijagnostički test za sifilis od T.Rathlev (1965,1967), T.Tomizawa (1966). Makromodifikacija reakcije se zove TRHA, mikromodifikacija je MNA-TR, automatska verzija je AMNA-TR, reakcija sa poliurea makrokapsulama umjesto crvenih krvnih zrnaca je MSA-TR. Osetljivost i specifičnost RPGA su slične RIBT, RIF, ali RPGA ima manju osetljivost u ranim oblicima sifilisa u poređenju sa RIF-abs i veću u kasnijim oblicima kongenitalnog sifilisa. RPGA se isporučuje u kvalitativnoj i kvantitativnoj verziji.

Tehnika uzimanja krvi za serološke testove

Za ispitivanje na RV, RIF, RIBT krv se uzima iz ulnarne vene na prazan želudac ili ne ranije od 4 sata nakon obroka pomoću sterilnog šprica ili jedne igle (gravitacijom). Na mjestu sakupljanja koža je prethodno tretirana 70% alkoholom. Špric i iglu treba oprati izotoničnim rastvorom natrijum hlorida. U čistu, suvu, hladnu epruvetu sipa se 5-7 ml test krvi. Na epruvetu se lijepi prazan komad papira s prezimenom, inicijalima, anamnezom ili brojem ambulantne kartice pacijenta i datumom uzimanja krvi. Nakon uzimanja krvi, epruveta se stavlja u frižider na temperaturu od +4°+8°C do sledećeg dana. Sljedećeg dana serum se cijedi radi testiranja. Ako se krv ne upotrebi narednog dana, serum se mora iscijediti iz ugruška i čuvati u frižideru ne duže od 1 nedelje. Za RIBT testiranje, epruveta mora biti posebno pripremljena i sterilna. U slučaju kršenja pravila za prikupljanje krvi za istraživanje, nepoštivanje uslova može dovesti do izobličenja rezultata.
Ne preporučuje se vađenje krvi za analizu nakon jela, pijenja alkohola, uzimanja raznih lijekova, nakon primjene raznih vakcina ili tokom menstrualnog ciklusa kod žena.
Za istraživanje ekspresnom metodom, krv je uzeta sa vrha prsta, kao što se radi kod uzimanja za ESR, ali je krv uzeta iz 1 kapilare više. Ekspresna metoda se može izvesti i sa krvnim serumom dobijenim venepunkcijom. Ako postoji potreba za ispitivanjem krvi u udaljenim laboratorijama, umjesto krvi se može poslati suhi serum (metoda suhe kapi). Da biste to učinili, sljedeći dan nakon uzimanja krvi, serum se odvaja od ugruška i uvlači u sterilnu špricu u količini od 1 ml. Zatim se serum u obliku 2 odvojena kruga izlije na traku debelog papira za pisanje (voštani papir ili celofan) dimenzija 6x8 cm.Na slobodnom rubu je ispisano prezime, inicijali ispitanika i datum uzimanja krvi. papir. Papir sa serumom zaštititi od direktne sunčeve svjetlosti i ostaviti na sobnoj temperaturi do sljedećeg dana. Serum se suši u obliku malih krugova sjajnog žućkastog staklastog filma. Nakon toga, trake papira sa osušenim serumom smotaju se kao farmaceutski prah i šalju u laboratoriju sa naznakom dijagnoze i svrhe za koju se ispituje.

Serološka rezistencija

Kod nekih (2% ili više) pacijenata sa sifilisom, uprkos potpunoj antisifilitičkoj terapiji, dolazi do usporavanja (odsutnosti) negativnih seroloških reakcija nakon završetka liječenja do 12 mjeseci ili više. Javlja se takozvana serološka rezistencija, koja se posljednjih godina često uočava. Postoje oblici serološke rezistencije:

• Istinito(apsolutno, bezuslovno) - potrebno je provesti dodatni antisifilitički tretman, u kombinaciji sa nespecifičnom terapijom za povećanje imunoloških snaga organizma.
• Relativno- nakon potpunog tretmana, treponema pallidums formira ciste ili L-forme, koji su u tijelu u niskovirulentnom stanju i kao rezultat toga dodatni tretman ne mijenja pokazatelje seroloških reakcija, posebno RIF i RIBT.

Istovremeno, kod oblika ciste se javljaju manji metabolički procesi, a ljuske cističnih oblika su strani protein (antigen). Da bi se zaštitilo, tijelo proizvodi specifična antitijela, koja su pozitivna ili jako pozitivna kada se izvode serološke reakcije i nema manifestacija bolesti. Kod L-forma, metabolički procesi su smanjeni, a antigena svojstva izostaju ili su blago izražena. Specifična antitijela se ne proizvode ili su u malim količinama, serološke reakcije su slabo pozitivne ili negativne. Što je duži vremenski period od trenutka infekcije, veći broj Treponema pallidums se transformiše u forme za preživljavanje (ciste, spore, L-oblike, zrna), kod kojih antisifilitička terapija nije efikasna.

Pseudo-otpor- nakon tretmana, uprkos pozitivnim serološkim reakcijama, Treponema pallidum je odsutna u organizmu. U tijelu nema antigena, ali se nastavlja proizvodnja antitijela koja se otkrivaju tokom seroloških reakcija.
Serološka rezistencija se može razviti zbog:

• neadekvatan tretman bez uzimanja u obzir trajanja i stadijuma bolesti;
• nedovoljna doza, a posebno zbog neuzimanja u obzir tjelesne težine pacijenata;
• kršenje intervala između primjene lijeka;
• perzistencija treponema pallidum u organizmu uprkos potpunom specifičnom tretmanu, zbog njihove rezistencije na penicilin i druge hemoterapijske lekove u prisustvu skrivenih, incistiranih lezija u unutrašnjim organima, nervnom sistemu, limfnim čvorovima, koji su nedostupni antibakterijskim lekovima (treponema pallidum često se nalaze u ožiljnim tkivima mnogo godina nakon završetka terapije, u limfnim čvorovima ponekad je moguće otkriti treponema pallidum 3-5 godina nakon antisifilitičke terapije);
• smanjenje zaštitnih snaga kod raznih bolesti i intoksikacija (endokrinopatije, alkoholizam, narkomanija itd.);
• opšta iscrpljenost (jedenje hrane siromašne vitaminima, proteinima, mastima).

Osim toga, često se otkriva lažna pozitivnost seroloških reakcija, što nije povezano s prisustvom sifilisa kod pacijenata i uzrokovano je:

• popratne nespecifične bolesti unutrašnjih organa, poremećaji kardiovaskularnog sistema, reumatizam, disfunkcija endokrinog i nervnog sistema, teške kronične dermatoze, maligne neoplazme;
• oštećenje nervnog sistema (teške povrede, potres mozga, mentalne traume);
• trudnoća; kronična intoksikacija alkoholom, nikotinom, drogama; zarazne bolesti (malarija, tuberkuloza, virusni hepatitis, dizenterija, tifus, tifus i povratna groznica).

Ovi faktori mogu uticati na imunološku reaktivnost organizma kako tokom perioda aktivnog razvoja sifilitičkih manifestacija tako i tokom njihovog regresije.