Polümeraasi ahelreaktsiooni PCR meetod võimaldab teil määrata. Polümeraasi ahelreaktsioon

⁰

MEETODI PÕHIMÕTE (molekulaarbioloogiline alus)

DNA analüüsi mitmesuguste hübridiseerimismeetodite hulgast PCR meetod Kõige laialdasemalt kasutatav kliinilises laboridiagnostikas.

Meetodi põhimõte polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)(Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)) töötas välja Kary Mullis (Cetus, USA) 1983. aastal. ja seda kasutatakse praegu laialdaselt nii teadusuuringutes kui ka diagnostikas praktiline tervishoid ja riiklik sanitaar- ja epidemioloogilise järelevalve talitus (genotüpiseerimine, diagnostika nakkushaigused).

PCR-meetod põhineb looduslikul protsessil - DNA maatriksi komplementaarsel täiendamisel, mis viiakse läbi ensüümi DNA polümeraasi abil. Seda reaktsiooni nimetatakse DNA replikatsioon.

Looduslik DNA replikatsioon hõlmab mitut etappi:

1) DNA denatureerimine(kaksikheeliksi lahtikerimine, DNA ahelate lahknemine);

2) Lühikeste kaheahelaliste DNA lõikude moodustumine(DNA sünteesi algatamiseks vajalikud praimerid);

3) Uue DNA ahela süntees(mõlema lõime täiendav lõpetamine)

Seda protsessi saab kasutada koopiate saamiseks spetsiifilistele mikroorganismidele spetsiifilised DNA lühikesed lõigud, need. teostada selliste spetsiifiliste piirkondade sihipärast otsingut, mis on geenidiagnostika eesmärk tuvastada nakkushaiguste patogeene.

Termofiilsete bakterite termostabiilse DNA polümeraasi (Taq polümeraasi) avastamine Thermis aquaticus, mille optimaalne temperatuur jääb vahemikku 70-72°C, võimaldas muuta DNA replikatsiooni protsessi tsükliliseks ja kasutada seda tööks in vitro. Programmeeritavate termostaatide (võimendite) loomine, mis teostavad tsüklilisi temperatuurimuutusi vastavalt etteantud programmile, on loonud eeldused PCR-meetodi laialdaseks kasutuselevõtuks laboratoorse kliinilise diagnostika praktikas. Sünteesitsüklite mitmekordsel kordamisel suureneb konkreetse DNA fragmendi koopiate arv eksponentsiaalselt, mis võimaldab väikesest kogusest analüüsitavast materjalist saada piisava arvu DNA koopiaid, mis võivad sisaldada üksikuid mikroorganismirakke. tuvastada need elektroforeesi abil.

Komplementaarne ahela lõpetamine ei alga ühestki DNA järjestuse punktist, vaid ainult teatud lähteplokkidest – lühikestest kaheahelalistest lõikudest. Kinnitades selliseid plokke spetsiifiliste DNA lõikude külge, on võimalik suunata uue ahela sünteesi protsessi ainult selles osas, mitte aga kogu DNA ahela pikkuses. Antud DNA lõikudes lähteplokkide loomiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidpraimerit (20 nukleotiidipaari), nn. praimerid. Praimerid on komplementaarsed DNA järjestustega vasakul ja õiged piirid spetsiifiline fragment ja on orienteeritud nii, et uue DNA ahela valmimine toimub ainult nende vahel.

Seega on PCR spetsiifilise DNA piirkonna koopiaarvu (amplifikatsiooni) mitmekordne suurenemine, mida katalüüsib ensüüm DNA polümeraas.

Võimendi läbiviimiseks on see vajalik järgmised komponendid:

Deoksünukleotiidtrifosfaatide (dNTP) segu(segu neljast dNTP-st, mis on materjal uute komplementaarsete DNA ahelate sünteesiks)

Ensüüm Taq polümeraas(termostabiilne DNA polümeraas, mis katalüüsib praimerite ahelate pikenemist, lisades järjestikku nukleotiidaluseid sünteesitud DNA kasvavasse ahelasse).

Puhverlahus(ensüümi aktiivsuse säilitamiseks vajalik Mg2+ ioone sisaldav reaktsioonikeskkond)
RNA viiruste genoomi spetsiifiliste piirkondade tuvastamiseks saadakse esmalt RNA matriitsist DNA koopia, kasutades pöördtranskriptsiooni (RT) reaktsiooni, mida katalüüsib ensüüm revertaas (pöördtranskriptaas).

Soovitud iseloomuliku DNA fragmendi piisava arvu koopiate saamiseks hõlmab amplifikatsioon mitut (20-40) tsüklit.

Iga võimendustsükkel sisaldab 3 etappi, mis toimuvad erinevates temperatuuritingimustes

1. etapp: DNA denatureerimine(topeltspiraali lahtipunumine). Toimub 93-95°C juures 30-40 sekundit.

2. etapp: praimerite kinnitamine (anniilimine). Praimerite liitumine toimub komplementaarselt vastandlike DNA ahelate vastavate järjestustega konkreetse piirkonna piiridel. Igal praimerite paaril on oma anniilimistemperatuur, mille väärtused jäävad vahemikku 50-65°C. Lõõmutamise aeg -20-60 sek.

3. etapp: DNA ahelate valmimine. DNA ahelate täiendav lisamine toimub ahela 5'-otsast 3'-otsa vastassuundades, alustades praimeri kinnituskohtadest. Uute DNA ahelate sünteesi materjaliks on lahusele lisatud desoksüribonukleotiidtrifosfaadid (dNTP-d). Sünteesiprotsessi katalüüsib ensüüm termostabiilne DNA polümeraas (Taq polümeraas) ja see toimub temperatuuril 70-72°C. Sünteesiaeg on 20-40 sekundit.

Esimeses amplifikatsioonitsüklis moodustunud uued DNA ahelad toimivad mallidena teisele amplifikatsioonitsüklile, milles moodustub soovitud spetsiifiline DNA fragment (amplikon). (vt joonis 2). Järgnevates amplifikatsioonitsüklites toimivad amplikonid uute ahelate sünteesi mallina. Seega akumuleeruvad amplikonid lahusesse vastavalt valemile 2n, kus n on võimendustsüklite arv. Seega, isegi kui alglahus sisaldas algselt ainult ühte kaheahelalist DNA molekuli, siis 30-40 tsükli jooksul koguneb lahusesse umbes 108 amplikonimolekuli. Sellest kogusest piisab selle fragmendi usaldusväärseks visuaalseks tuvastamiseks agaroosgeelelektroforeesi abil. Võimendusprotsess viiakse läbi spetsiaalses programmeeritavas termostaadis (võimendis), mis vastavalt etteantud programmile muudab automaatselt temperatuure vastavalt võimendustsüklite arvule.

PCR ANALÜÜSI ETAPID

PCR-meetod kui vahend nakkushaiguste laboratoorseks diagnoosimiseks põhineb patogeeni väikese DNA fragmendi (mitusada aluspaari), mis on spetsiifiline ainult antud mikroorganismile, tuvastamisel, kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni, et koguda soovitud kogus. fragment.
PCR-meetodit kasutav analüüsiprotseduur koosneb kolmest etapist:

1. DNA (RNA) eraldamine kliinilisest proovist

2. Spetsiifiliste DNA fragmentide amplifitseerimine
3. Võimendusproduktide tuvastamine

DNA (RNA) eraldamine
Selles analüüsi etapis allutatakse kliiniline proov eritöötlusele, mille tulemusena toimub rakulise materjali lüüs, valgu- ja polüsahhariidide fraktsioonide eemaldamine ning DNA või RNA lahuse saamine.
inhibiitorid ja valmis edasiseks amplifikatsiooniks.
DNA (RNA) isoleerimistehnika valiku määrab peamiselt töödeldava kliinilise materjali iseloom.

Spetsiifiliste DNA fragmentide amplifitseerimine
Selles etapis koguneb lühikesi spetsiifilisi DNA fragmente nende edasiseks tuvastamiseks vajalikus koguses. Enamik konkreetsete genoomi fragmentide määramise meetodeid kasutab nn. "sihitud PCR klassikaline versioon. Analüüsi spetsiifilisuse ja tundlikkuse suurendamiseks kasutavad mõned meetodid "pesastatud" PCR-meetodit, mis kasutab 2 paari praimereid ("väline" - 1. etapi jaoks ja "sisemine" - 2. etapi jaoks).

Võimendusproduktide tuvastamine
Enamiku meetodite puhul eraldatakse selles etapis 2. etapis saadud amplifikatsiooniproduktide segu horisontaalse elektroforeesiga agaroosgeelis. Enne elektroforeetilist eraldamist lisatakse amplifikatsioonisegule etiidiumbromiidi lahus, mis moodustab tugevad interstitsiaalsed ühendid kaheahelaliste DNA fragmentidega. Need ühendid on võimelised fluorestseeruma UV-kiirguse all, mis registreeritakse pärast amplifikatsioonisegu elektroforeetilist eraldamist agaroosgeelis oranžikaspunaste helendavate ribadena.

Alternatiivina elektroforeetilisele tuvastamismeetodile, millel on mõned puudused: subjektiivsus tulemuste lugemisel, piirangud erinevate mikroorganismide DNA määramisel ühes reaktsioonis, võib selle välja pakkuda. hübridisatsiooni tuvastamise skeemid. Nendes skeemides hübridiseerub amplifikatsiooni tulemusena tekkinud DNA fragment (moodustab 2-ahelalised kompleksid - “hübriidid”) spetsiifilise oligonukleotiidsondiga. Selliste komplekside registreerimine võib toimuda kolorimeetriliselt või fluorimeetriliselt. SPF "Litekh" on loonud tuvastuskomplektid, mis põhinevad hübridisatsioonil ja tulemuste fluorimeetrilisel registreerimisel

PCR-MEETODI EELISED kui nakkushaiguste diagnoosimise meetod:

- Patogeenide esinemise otsene määramine

Palju traditsioonilised meetodid diagnostika, näiteks ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs, tuvastab markervalgud, mis on nakkusetekitajate jääkproduktid, mis annab ainult kaudseid tõendeid infektsiooni esinemise kohta. Patogeeni DNA spetsiifilise lõigu identifitseerimine PCR abil annab otsese viite nakkustekitaja olemasolule.

- Kõrge spetsiifilisus
PCR-meetodi kõrge spetsiifilisus tuleneb asjaolust, et uuritavas materjalis tuvastatakse ainulaadne DNA fragment, mis on iseloomulik ainult antud patogeenile. Spetsiifilisus määratakse praimerite nukleotiidjärjestuse järgi, mis elimineerib
erinevalt meetodist valetulemuste saamise võimalus ensüümi immuunanalüüs, kus ristreageerivatest antigeenidest tulenevad vead on tavalised.

- Kõrge tundlikkus
PCR-meetod võimaldab tuvastada isegi üksikuid bakteri- või viirusrakke. PCR-diagnostika tuvastab nakkushaiguste patogeenide esinemise juhtudel, kui kasutatakse muid meetodeid (immunoloogiline, bakterioloogiline,
mikroskoopiline) seda ei saa teha. PCR analüüsi tundlikkus on 10-1000 rakku proovi kohta (immunoloogiliste ja mikroskoopiliste testide tundlikkus on 103-105 rakku).

- Erinevate patogeenide tuvastamise protseduuri ülikool
PCR-meetodil uurimistöö materjaliks on patogeeni DNA. Meetod põhineb konkreetsele organismile spetsiifilise DNA või RNA fragmendi tuvastamisel. Sarnasused keemiline koostis kõigist nukleiinhapetest võimaldab laboriuuringute läbiviimiseks kasutada ühtseid meetodeid. See võimaldab ühest bioproovist diagnoosida mitut patogeeni. Uuritava materjalina võib kasutada erinevaid bioloogilisi eritisi (lima, uriin, röga), epiteelirakkude kraapimist, verd ja seerumit.

- Suur kiirus saadud analüüsi tulemus
PCR analüüsi läbiviimiseks ei ole vaja isoleerida ja kasvatada patogeeni kultuuri, mis võtab suur hulk aega. Ühtne meetod biomaterjali töötlemiseks ja reaktsiooniproduktide tuvastamiseks ning amplifikatsiooniprotsessi automatiseerimine võimaldab läbi viia täielik analüüs 4-4,5 tunni jooksul.

Tuleb märkida, et PCR-meetodi abil saab tuvastada patogeene mitte ainult patsiendilt saadud kliinilises materjalis, vaid ka objektidelt saadud materjalis. väliskeskkond(vesi, muld jne)

PCR MEETODI RAKENDAMINE PRAKTILISES TERVISHOIUS

Kasutades PCR meetodit nakkushaiguste diagnoosimisel, nii bakteriaalsete kui viiruslik iseloom on tohutu tähtsus paljude mikrobioloogia ja epidemioloogia probleemide lahendamisel. Arengule aitab kaasa ka selle meetodi kasutamine alusuuringud krooniliste ja halvasti mõistetavate nakkushaiguste uurimise valdkonnas.

Meetodit on kõige tõhusam ja majanduslikult otstarbekam kasutada:

urogünekoloogiline praktika- klamüüdia, ureaplasmoosi, gonorröa, herpese, gardnerelloosi, mükoplasma infektsiooni tuvastamiseks;

pulmonoloogias- viirusliku ja bakteriaalse kopsupõletiku, tuberkuloosi diferentsiaaldiagnostikaks;

gastroenteroloogias- helikobakterioosi tuvastamiseks;

nakkushaiguste kliinikus- kiirmeetodina salmonelloosi, difteeria, viirusliku diagnoosimiseks hepatiit B, C ja G;

hematoloogias- tsütomegaloviiruse infektsiooni, onkoviiruste tuvastamiseks.

Sisu

Uute diagnostikameetodite huvilised peaksid uurima, mis on PCR meetod. Kaasaegsed tehnilised võimalused laboriuuringute valdkonnas võimaldavad tuvastada paljusid haigusi esialgsed etapid. Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) peetakse Sel hetkel kõige täpsem ja uus meetod.

PCR analüüs

PCR analüüs - mis see on? See meetod kasutab molekulaarbioloogia põhimõtteid. Materjali uurimiseks kasutatakse spetsiaalseid ensüüme, mis kopeerivad korduvalt ja kiiresti patogeenide DNA ja RNA fragmente. Olemas erinevad tüübid PCR analüüs sõltuvalt uuritavast materjalist (veri, uriin, väljaheited jne). Pärast töötlemist võrdlevad laboritöötajad saadud tulemust andmebaasiga, tuvastavad patogeeni kontsentratsiooni ja tüübi.

PCR analüüs asetatakse spetsiaalsesse tsüklerisse (seadmesse), mis soojendab ja jahutab tuube biomaterjaliga. Temperatuurimuutused on vajalikud fragmentide replikatsiooniks. Tulemuse täpsus sõltub temperatuurirežiimi täpsusest. Polümeraasi ahelreaktsiooni meetod aitab tuvastada:

Nakkuslik mononukleoos;
tsütomegalo viirusnakkus;
viirushepatiit G, C, B, A;
sugulisel teel levivad infektsioonid/haigused (STI-d/STD-d): gardnerelloos, trihhomoniaas, ureaplasmoos;
herpese infektsioon;
onkogeensed viirused;
listerioos;
Helicobacter pylori infektsioon;
puukentsefaliit, borrelioos;
tuberkuloos;
kandidoos.

Veri

Hetkel on tehnoloogia uudsuse tõttu PCR-vereanalüüsil veel kõrge hind. Biomaterjali ettevalmistamiseks ei pea te täitma teatud nõudeid. Isegi põhjustatud kehaline aktiivsus, stress, muutused toitumises, muutused koostises ei mõjuta uuringu tulemusi. PCR-i vereanalüüsi saab rikkuda ainult antibakteriaalsete ainete võtmine, seega peate enne testi tegemist tegema pausi ravi ja testi vahel.

PCR-vereanalüüs on kõige levinum võimalus kroonilise, ägeda diagnoosimiseks nakkuslikud patoloogiad viirusliku või ebatüüpilise ilminguga. Seroloogilised meetodid Uuringute läbiviimisel on teatud raskused - patogeeni olemasolu määrab antikehade olemasolu inimkehas. Tulemus võib olla valenegatiivne, kui patsiendi seisund ei võimaldanud nende arenguks aega.

määrima

Günekoloogia valdkonnas kasutatakse nakkusohtlike mikroorganismide esinemise uurimiseks PCR-määrianalüüsi. Materjaliga töötamine toimub samal põhimõttel nagu verega: patogeeni DNA fragmentide mitmekordne suurendamine, et seda hõlpsalt tuvastada. See aitab ka tuvastada varjatud infektsioonid naises. Analüüsiks võib võtta erinevaid bioloogilisi vedelikke: sülge, röga, uriini, verd. Günekoloogias kasutatakse täpseks määramiseks sageli emakakaela kanalist tupe limaskesta määrdumist.

PCR-i läbiviimiseks on teatud näidustused. Sageli tuleb seda teha antibiootikumide suhtes resistentse patogeeni tuvastamiseks. Naistel on selle meetodi abil diagnoosimise peamised näidustused järgmised:

raske rasedus;
STI-de äge faas;
kui on kahtlus, et STI on arenenud kroonilisse staadiumisse;
viljatuse põhjuste otsimine.

Kala

Infektsiooni tuvastamiseks võib arst määrata PCR-i väljaheite testi. Pärast testi kõige usaldusväärsemate tulemuste saamiseks peate enne biomaterjali kogumist järgima järgmisi reegleid:

lõpetage lahtistite võtmine paar päeva enne: õlid, ravimküünlad;
välistage ravimid, mis annavad väljaheitele teatud värvi, näiteks rauda sisaldavad.

Uriin

Vajadusel võib arst analüüsiks võtta uriini. Suur täpsus avab võimaluse töötada mis tahes bioloogilise vedelikuga, millest saab eraldada viiruse DNA. PCR uriinianalüüsi tegemiseks peate enne materjali kogumist järgima järgmisi piiranguid:

lõpetage seksuaalvahekord vähemalt 1 päev enne protseduuri;
3 nädalat enne testi tuleks lõpetada antibakteriaalne ravi, sest ravimid muudavad pildi häguseks;
Testi tuleb teha tühja kõhuga (ka vedelikud on keelatud);
Peate võtma materjali esimese hommikuse osa.

PCR testi tulemused

Eelnevast on selge, mis on PCR analüüs ja selle uurimismeetodi selged eelised on nähtavad. Selle diagnostilise protseduuri teine eelis on tulemuste dešifreerimise lihtsus. Arvestades, kui kaua PCR analüüs aega võtab (protsess ise võtab aega umbes 5 tundi, aga labor toodab andmed 1-2 päevaga), seda meetodit diagnostika on muutumas parimaks võimaluseks paljude infektsioonide tuvastamiseks. Tulemuste põhjal võib arst teile öelda, et test:

Negatiivne – uuritav materjal ei sisaldanud soovitud patogeeni.
Positiivne - leiti patogeeni RNA ja DNA.

Mõnikord tehakse mikroorganismide kvantitatiivne määramine. See on vajalik oportunistlike patogeenide põhjustatud haiguste puhul. Nende viiruste eripära seisneb selles, et neid esineb ainult liigsetes kogustes ja nende leidmine tavauuringute abil on äärmiselt problemaatiline. See tegur on oluline terapeutilise taktika valimisel viirusnakkuste, näiteks hepatiidi, HIV tõhusaks raviks.

12 infektsiooni korral

Et täielikult mõista, mis see on PCR diagnostika infektsioonide ja selle tõhususe kohta peate teadma, et see suudab eraldada kuni 12 patogeeni. Tekst viiakse läbi ainult laboritingimustes. Uurimiseks kasutatakse spetsiaalseid ensüüme, mis suurendavad viiruse RNA ja DNA fragmentide hulka mitu korda. 12 infektsiooni PCR-analüüs võib tuvastada:

Mycobacterium tuberculosis;
tsütomegaloviirus;
hepatiit C, G, B, A;
herpes 1, 2 tüüpi;
Epstein-Barri viirus (nakkuslik mononukleoos);
sugulisel teel levivad infektsioonid, näiteks klamüüdia;
listerioos;
Candida infektsioon;
Helicobacter pylori;
borrelioos, puukentsefaliit.

C-hepatiidi korral

See diagnostiline meetod aitab kindlaks teha viiruse olemasolu veres. See annab arstidele võimaluse rääkida selle olemasolust või puudumisest. C-hepatiidi PCR analüüsi on kahte tüüpi: kvalitatiivne ja kvantitatiivne. Esimene valik näitab ainult selle olemasolu ja sellel võib olla sõnastus "tuvastatud"/"ei tuvastatud". Seda tüüpi testi tundlikkus on 10-500 IU/ml. See tähendab, et kui patogeeni sisaldus organismis on madal, siis analüüsi "ei tuvastata".

Kvantitatiivne analüüs on täpsem ja näitab infektsiooni kontsentratsiooni veres. Seda indikaatorit nimetatakse "viiruskoormuseks" ja seda mõõdetakse viiruse RNA kogusena konkreetse veremahu kohta. Dekodeerimine erinevates laborites võib erineda. Lisaks IU/ml mõõtmisele kasutatakse “koopia” ühikuid. Saate lugeda koopiaid RÜ kohta, kasutades valemit: 1 IU = 4 koopiat. Kui viiruse esinemise dekodeerimisväärtus ületab 800 000 RÜ/ml (või 800*103), viitab see patogeeni suurele sisaldusele.

Tuberkuloosi vastu

Katse tuleks teha hommikul. See on oluline selleks, et vältida kogu öö jooksul tekkinud rögamassi maost väljumist. Tuberkuloosi PCR-analüüs on sama oluline kui ELISA, Mantoux ja tomograafia. Uuring aitab tuvastada mükobakterite esinemist, uriini seisundit, koguimmunoglobuliini, ESR-i ja määrata kopsude hetkeseisundit. Täpsete tulemuste tagamiseks tuleb PCR-analüüs läbi viia vastavalt järgmistele reeglitele:

Külvamine toimub 3 korda, kuid maosisu täielik aspireerimine peaks toimuma ainult haiglatingimustes.
Mükobakterid avastatakse maos olemasolevate masside külvi abil vähem kui 50% diagnoosidest. Isegi optimaalsete tingimuste saavutamisel soovitatakse selle asemel teha ultraheli.
Isegi kui tulemus on negatiivne, ei saa täielikult välistada tuberkuloosi tekkimise võimalust ESR-i, immunoglobuliini või muude näitajate muutustega.
Materjalide inokuleerimine PCR-i ajal on vähem vastuvõtlik patoloogilised seisundid, kui see on saadud bronhoskoopilise uuringu käigus, mis välistab lapse tuberkuloosi kahtluse.

HIV-i jaoks

Paljude inimeste jaoks see diagnoos peetakse surmaotsuseks. Sel põhjusel muutub inimene pärast sagedast seksuaalvahekorda tähelepanelikumaks signaalide suhtes, mida tema keha annab (ja mõnikord mõtleb need välja). Kõige usaldusväärsem võimalus selle haiguse kinnituse või ümberlükkamise saamiseks on HIV-i PCR-test. Testi abil saab kindlaks teha järgmist võimalikud probleemid tervisega:

HIV-i olemasolu ümberlükkamine/kinnitus seronegatiivsel perioodil.
HIV-1, HIV-2 genotüübi määramine.
Kirjelduse täpsustamine patoloogiline protsess kui immunobloti tulemus on küsitav.
Infektsioon pärast vereülekannet.
HIV-staatuse määramine lastel, kes on sündinud haiguse kandjatest emadel.
Aitab jälgida keha viiruskoormust.

HPV jaoks

Papilloomiviirust saab tuvastada igal inimesel, pikka aega see võib olla varjatud olekus. Arengut provotseerib nõrgenenud immuunsus, stress või emotsionaalsed puhangud. HPV PCR-test aitab määrata viiruse kontsentratsiooni veres. Sel põhjusel on soovitatav teha kvantitatiivsed, mitte kvalitatiivsed määramised. Need andmed aitavad ennustada pahaloomulise infektsiooni tõenäosust.

HPV olemasolu diagnoosimise meetod põhineb PCR-i peamisel omadusel eraldada materjalist viiruse DNA. Testi kõrge tundlikkuse tõttu tuvastatakse isegi väike kogus baktereid. Kvantitatiivsed uuringud annavad arstidele võimaluse määrata haiguse ohtlikkuse aste ja teha prognoos tulevikuks. See diagnoos on kohustuslik kõigile meestele ja naistele, kes on avastanud kondüloomid. Kvantitatiivne PCR-analüüs aitab kindlaks teha, mis põhjustas HPV arengu: ajutine immuunsuse vähenemine või krooniline haigus.

Herpese puhul

Seda tüüpi diagnostika mikrobioloogias aitab suure täpsusega läbi viia herpese PCR-analüüsi. Viiruse DNA fragmentide kopeerimine toimub ainult siis, kui materjalis on soovitud geen. Sellisel juhul võivad testi tulemused näidata patogeeni olemasolu või puudumist. Seda saab tuvastada isegi madala kontsentratsiooni korral veres.

PCR-analüüsi eeliseks on ka see, et see suudab tuvastada herpesviirusinfektsiooni kohe pärast nakatumist, enne selle ilmnemist kliinilised sümptomid. Saate määrata herpese tüübi (1 või 2 ei ole testi tegemiseks vajalik, kuid arstid soovitavad enne vere võtmist keelduda:

praetud;
äge;
alkohol;
rasva.

Raseduse ajal

Lapse kandmisel on väga oluline see uuring läbi viia, et registreerida naise seisund. PCR-analüüs raseduse ajal on kantud kõige enam tõhusad meetodid erinevate haiguste esinemise määramine. Katse on vajalik mitte ainult patoloogiate tuvastamiseks, vaid ka lapse emakasisese nakatumise tõenäosuse määramiseks. Ainult tänu PCR-diagnostikale sai võimalikuks tuvastada progresseerumise aste, paljude infektsioonide areng emakas.

PCR-testide võtmine

Kui soovite teada, kuidas PCR-analüüsi tehakse, tuleks kaaluda iga üksikjuhtumit, võttes arvesse biomaterjali tüüpi. Kraapimisel, määrimisel või verevõtul on oma omadused, näiteks:

plasma annetatakse hommikul;
uriin võetakse ainult kõigepealt hommikul, laboritingimustes steriilses anumas;
määrimine või kraapimine on näitlik alles pärast seksuaalvahekorrast hoidumist vähemalt 3 päeva;
Menstruatsiooni ajal ja 2 päeva pärast seda ei saa määrida.

Kust saada PCR-testi

Seda tüüpi uuringud viitavad kaasaegsetele ja kõrgtehnoloogilistele diagnostikameetoditele. PCR-meetodit kasutavad testid tuleks teha laborites, kus on täielike tulemuste saamiseks kõik vajalikud seadmed. Sama oluline roll on kvalifitseeritud ja koolitatud personalil. Eelistage suuri, tõsiseid, tuntud laboreid. See mitte ainult ei aita teil kiiresti tulemusi saada, vaid tagab ka nende usaldusväärsuse.

Hind

Teine küsimus, mis patsiente sageli huvitab: kui palju maksab PCR-test? Meetodi uudsuse ja kallite seadmete ostmise vajaduse tõttu on testi hind suhteliselt kõrge. PCR-i maksumus sõltub infektsiooni tüübist, mille suhtes inimest testitakse. Testide ligikaudne hind ja aeg on järgmised:

STI-d kontrollitakse 1 päeva pärast, hind on 400-500 rubla.
Herpes, HPV, Epstein-Barri viirus, tsütomegloviirus tuvastatakse 24 tunni jooksul, hind – 300-500 rubla.
Hepatiidi analüüs tehakse 5 päeva jooksul, kvalitatiivse variandi hind on 500 rubla, kvantitatiivne variant 2000 rubla.
Helicobacter pylori tuvastatakse 24 tunni jooksul, hind on 400 rubla.
Antigeenid, HIV-antikehad, hind - alates 380 rubla.
HIV RNA kvalitatiivne analüüs, hind - alates 3500 rubla.
HIV RNA kvantitatiivne analüüs, hind - alates 11 000 rubla.

Video

Tähelepanu! Artiklis esitatud teave on ainult informatiivsel eesmärgil. Artiklis olevad materjalid ei soodusta eneseravi. Ainult kvalifitseeritud arst saab teha diagnoosi ja anda ravisoovitusi konkreetse patsiendi individuaalsete omaduste põhjal.

Kas leidsite tekstist vea? Valige see, vajutage Ctrl + Enter ja me parandame kõik!

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR, PCR - polümeraasi ahelreaktsioon) on meetod teatud DNA fragmentide (geenide) mitme koopia saamiseks bioloogilises proovis.

PCR-i kui molekulaarbioloogia meetodi olemus seisneb konkreetse geeni (DNA osa) korduv selektiivne kopeerimine spetsiaalsete ensüümide abil teatud tingimustel. in vitro. PCR-i oluline tunnus on spetsiifilise DNA lõigu (geeni) koopiate tootmine, mis vastab kindlaksmääratud tingimustele. DNA kopeerimise protsessi sünonüüm on "amplifikatsioon". DNA replikatsioon in vivo võib pidada ka võimenduseks. Erinevalt replikatsioonist amplifitseerib polümeraasi ahelreaktsiooni protsess DNA lühikesi lõike (maksimaalselt 40 000 aluspaari).

Põhiprintsiibid

Seega on PCR teatud DNA fragmentide korduv kopeerimine in vitro korduvate temperatuuritsüklite ajal. Kuidas toimub reaktsiooniprotsess ühe temperatuuritsükli jooksul?

Nukleotiidahela moodustumine toimub ensüümi DNA polümeraasi abil. Töö alustamiseks vajab ensüüm aga stardiplatvormi. Platvormid on "praimerid" (külvijad) - sünteetilised oligonukleotiidid pikkusega 15-20 nukleotiidi. Peab olema kaks praimerit (edasi ja tagurpidi), need täiendavad DNA matriitsi sektsioone ja DNA polümeraas kopeerib mitu korda praimeritega piiratud DNA fragmenti. Polümeraasi töö seisneb DNA matriitsi järjestusega komplementaarsete nukleotiidide järjestikuse lisamises. Seega sünteesitakse ühes temperatuuritsüklis taas kaks uut DNA fragmenti (kuna DNA molekul on kaheahelaline, siis maatriksit on esialgu kaks). Seega koguneb katseklaasi 25-35 tsükli jooksul miljardeid koopiaid praimerite poolt määratud DNA piirkonnast. Eraldi tsükli struktuuri saab esitada järgmiselt:

DNA denaturatsioon (sulamine, DNA ahelate lahknemine) - 95°C - 1 või 2 minutit;
praimerite anniilimine (praimerid seonduvad DNA matriitsiga, selle etapi temperatuur määratakse praimeri nukleotiidse koostise järgi) - 60°C (näiteks) - 1 minut;
DNA pikenemine (polümeraas sünteesib DNA ahela) - 72°C - 1 minut (aeg sõltub sünteesitava fragmendi pikkusest).

Instrumendid polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi kasutamiseks laboris peaksid koosnema:

(või, nagu seda nimetatakse ka termotsükleriks);
süsteemid s jaoks (PCR tulemuste visualiseerimiseks);
süsteemid (PCR tulemuste analüüsimiseks);
(proovi ettevalmistamiseks);
komplekt (mehaaniline või elektrooniline).

Lisaks põhi- ja abiseadmetele PCR-labori täielikuks toimimiseks on mõned Kulumaterjalid: steriilsed otsikud, katseklaasid, riiulid katseklaaside ja pipettide jaoks.

Täisväärtusliku polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimiseks mõeldud tavapärases PCR laboris on reaktiivi alus ensüüm DNA polümeraas koos puhvriga, praimerid (väikesed sünteetilised DNA fragmendid, mis on komplementaarsed DNA matriitsi analüüsitava osa alguse ja lõpuga), nukleotiidide segu (A, T, G, C). Puhastatud vesi on samuti hädavajalik.

PCR-meetodi eelised

Uuringu kõrge tundlikkus

Meetodi tundlikkus on selline, et PCR-iga on võimalik amplifitseerida ja identifitseerida sihtjärjestus isegi siis, kui see esineb üks kord 105 rakust koosnevas proovis.

Analüüsi spetsiifilisus

PCR võimaldab tuvastada konkreetse nakkustekitaja DNA teiste mikroorganismide DNA ja peremeesorganismi DNA juuresolekul, samuti teostada genotüpiseerimist. Spetsiaalselt reaktsioonikomponentide (praimerite) valimisel saate samaaegselt tuvastada lähedalt seotud mikroorganismide DNA-d.

PCR-meetodi mitmekülgsus

Fakt on see, et nakkushaiguste või inimese pärilike haiguste PCR-diagnostika jaoks saate kasutada samu seadmeid, järgida proovide ettevalmistamise ja analüüsimise universaalseid protseduure, samuti sama tüüpi reaktiivide komplekte.

Säästa aega

PCR-i oluline eelis on kultuurilise mikrobioloogilise töö etappide puudumine. Proovide ettevalmistamine, reaktsioonide läbiviimine ja tulemuste analüüsimine on võimalikult lihtne ja suures osas automatiseeritud. Tänu sellele saab tulemuste saavutamiseks kuluvat aega lühendada 4-5 tunnini.

PCR-meetodi efektiivsus

Uuritud kliinilise materjali laius

Polümeraasi ahelreaktsioonis ei saa proovina kasutada mitte ainult patsiendi bioloogilist materjali, vaid ka paljusid teisi substraate, milles DNA molekule saab kõrge tundlikkusega tuvastada, näiteks vesi, muld, toit, mikroorganismid, tampoonid ja palju muud. .

Kõik ülaltoodud eelised ainulaadne meetod - kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus, nakkustekitaja tuvastamine ja mis tahes inimese geeni genotüpiseerimine, kõrge efektiivsus ja aja kokkuhoid, instrumentide baasi mitmekülgsus – võimaldavad PCR-meetodit tänapäeval laialdaselt kasutada kliinilises diagnostikas, meditsiinipraktikas, teadusuuringutes, kvaliteedikontrollis ja paljudes muud valdkonnad.

PCR rakendamine

Polümeraasi ahelreaktsiooni kui kaasaegse molekulaarbioloogia meetodi rakendusalad on mitmekesised. See on suuresti tingitud analüüsitava materjali laiusest (uurimisobjektiks võib saada peaaegu kõik, millest saab eraldada enam-vähem kvaliteetse DNA), aga ka valitud praimerid. PCR-i peamised rakendusvaldkonnad:

kliiniline meditsiin

nakkushaiguste diagnoosimine
pärilike haiguste diagnoosimine
mutatsiooni tuvastamine
genotüpiseerimine
rakutehnoloogiad
geneetiliste passide loomine

ökoloogia

seisundi jälgimine keskkond
toidu analüüs
geneetiliselt muundatud organismide (GMO) analüüs

kohtumeditsiin ja kriminoloogia

isikutuvastus
isaduse tuvastamine

farmakoloogia

veterinaarmeditsiin

teadusuuringud (molekulaarbioloogia, geneetika)

PCR labori korraldamine

Tellimisinfo

Nimi	Helitugevus	Tootmine	meetod	Kassi nr.

GOU VPO "Krasnojarski Riiklik Meditsiiniakadeemia"

nime saanud Yasenetsky föderaalse tervise ja sotsiaalarengu agentuuri järgi »

osakond meditsiiniline geneetika ja IPO kliiniline neurofüsioloogia

MEETOD PÕHIPÕHIMÕTTED

POLÜMERAASI KETREAKTSIOON

Metoodiline käsiraamat 3-4 aastastele õpilastele

üldmeditsiini erialadel (060101) ja

Krasnojarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhiprintsiibid. Üldmeditsiini (060101) ja pediaatria (060103) erialade 3-4-aastaste üliõpilaste klassivälise töö metoodiline juhend. – Krasnojarsk: Riikliku Kutsekõrgkooli kirjastus KrasSMA, 2007. – 42 lk.

Metoodiline juhend vastab täielikult riikliku standardi (2000) nõuetele ja kajastab inimese pärilike haiguste diagnoosimise kaasaegse meetodi - polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi - põhiaspekte, õppematerjal kohandatud haridustehnoloogiatele, võttes arvesse koolituse spetsiifikat 3-4-aastastel arsti- ja pediaatrilistel teaduskondadel.

Arvustajad: Riikliku kutsekõrgkooli meditsiinigeneetika osakonna juhataja

"Föderaalse Terviseagentuuri Novosibirski Riiklik Meditsiiniülikool ja sotsiaalne areng", meditsiiniteaduste doktor, professor;

DNA replikatsioon

Selle meetodi uurimisobjektiks on desoksüribonukleiinhape (DNA). DNA on universaalne geneetilise teabe kandja kõigis Maal eksisteerivates organismides (välja arvatud RNA-d sisaldavad mikroorganismid). DNA on kahekordne ahel, mis on keerdunud spiraaliks. Iga ahel koosneb järjestikku ühendatud nukleotiididest. DNA ahelatel on vastupidised suunad: ühe ahela 5" ots vastab teise ahela 3" otsale. DNA ainulaadne omadus on selle võime kahekordistuda. Seda protsessi nimetatakse replikatsioon. DNA molekuli replikatsioon toimub interfaasi sünteetilisel perioodil. "Ema" molekuli mõlemad ahelad toimivad "tütre" mallina. Pärast replikatsiooni sisaldab äsja sünteesitud DNA molekul ühte "ema" ahelat ja teine on äsja sünteesitud "tütar" ahelat (poolkonservatiivne meetod). Uue DNA molekuli matriitsi sünteesiks on vajalik, et vana molekul oleks välja tõmmatud ja pikendatud. Replikatsioon algab DNA molekulis mitmest kohast. DNA molekuli lõiku ühe replikatsiooni alguspunktist teise replikatsiooni alguspunktini nimetatakse replikon.

Replikatsiooni algus on aktiveeritud praimerid(praimerid), mis koosnevad 100-200 nukleotiidipaarist. DNA helikaasi ensüüm kerib lahti ja jagab ema-DNA heeliksi kaheks ahelaks, millele komplementaarsuse põhimõttel DNA polümeraasi ensüümi osalusel monteeritakse DNA „tütar” ahelad. Ensüümi töö alustamiseks on vajalik lähteploki olemasolu - väike esialgne kaheahelaline fragment. Algplokk moodustub praimeri interaktsioonil lähte-DNA vastava ahela komplementaarse piirkonnaga. Igas replikonis saab DNA polümeraas liikuda mööda emaahelat ainult ühes suunas (5`=>3`).

Juhtahelal kasvab replikoni lahtikeeramisel järk-järgult pidevalt tütarahel. Mahajäänud ahelal sünteesib tütarahel ka suunas (5`=>3`), kuid replikoni lahtikerimisel eraldi fragmentidena.

Seega toimub "tütar" ahelate komplementaarsete nukleotiidide lisamine vastassuundades (antiparalleelne). Replikatsioon kõigis replikonites toimub samaaegselt. Erinevates replikonites sünteesitud "tütar" ahelate fragmendid ja osad õmmeldakse ensüümi ligaasi abil üheks ahelaks. Replikatsiooni iseloomustab poolkonservatiivsus, antiparallelism ja katkestus. Kogu raku genoom replitseeritakse üks kord ajaperioodi jooksul, mis vastab ühele mitootilisele tsüklile. Replikatsiooniprotsessi tulemusena moodustub ühest DNA molekulist kaks DNA molekuli, milles üks ahel on ema-DNA molekulist ja teine, tütar, äsja sünteesitud (joonis 1).

Riis. 1. DNA molekuli replikatsiooni skeem.

Seega hõlmab DNA replikatsioonitsükkel kolm peamist etappi:

1. DNA heeliksi lahtikerimine ja ahelate lahknemine (denaturatsioon);

2. kruntvärvide kinnitamine;

3. lapselõnga ahela lõpetamine.

PCR-meetodi põhimõte

See on DNA replikatsioon, mis on PCR aluseks. PCR-is viiakse ülaltoodud protsessid läbi katseklaasis tsüklilises režiimis. Üleminek ühest reaktsioonietapist teise saavutatakse inkubeerimissegu temperatuuri muutmisega. Kui lahus kuumutatakse temperatuurini 93-95 °C, toimub DNA denaturatsioon. Järgmise etapi – praimerite lisamise või “anniilimise” – jätkamiseks jahutatakse inkubatsioonisegu temperatuurini 50-65 °C. Järgmisena kuumutatakse segu temperatuurini 70-72 °C - taq-DNA polümeraasi jaoks optimaalne - selles etapis toimub uue DNA ahela konstrueerimine. Seejärel kordub tsükkel uuesti. Teisisõnu PCR meetod on koopiate arvu mitmekordne suurendamine (võimendus) DNA spetsiifiline osa, mida katalüüsib ensüüm DNA polümeraas.

Tütar-DNA ahelate kasv peab toimuma samaaegselt mõlemal ema DNA ahelal, seega on teise ahela replikatsiooniks vaja ka oma praimerit. Seega lisatakse reaktsioonisegule kaks praimerit: üks "+" ahela jaoks, teine "-" ahela jaoks. Olles kinnitunud DNA molekuli vastassuunaliste ahelatega, piirduvad praimerid selle osaga, mida hiljem paljundatakse või amplifitseeritakse. Sellise fragmendi, mida nimetatakse amplikoniks, pikkus on tavaliselt mitusada nukleotiidi.

PCR etapid

Iga võimendustsükkel sisaldab 3 erinevat etappi temperatuuri tingimused(joonis 2).

· 1. etapp: DNA denaturatsioon . Toimub 93-95° juures 30-40 sekundit.

· 2. etapp: praimeri lõõmutamine . Praimerite kinnitumine toimub komplementaarselt vastavate järjestustega vastandlikes DNA ahelates konkreetse piirkonna piiridel. Igal praimerite paaril on oma anniilimistemperatuur, mille väärtused jäävad vahemikku 50-65°C. Lõõmutamise aeg 20-60 sek.

· 3. etapp: DNA ahelate komplementaarne lõpetamine toimub ahela 5" otsast 3" otsani vastassuundades, alustades praimeri kinnituskohtadest. Uute DNA ahelate sünteesi materjaliks on lahusele lisatud desoksüribonukleosiidtrifosfaadid. Sünteesiprotsessi katalüüsib ensüüm taq polümeraas ja see toimub temperatuuril 70-72°C. Sünteesiaeg on 20-40 sekundit.

Esimeses amplifikatsioonitsüklis moodustunud uued DNA ahelad toimivad matriitsina teise amplifikatsioonitsükli jaoks, milles moodustub spetsiifiline DNA amplikoni fragment (joonis 3). Järgnevates amplifikatsioonitsüklites toimivad amplikonid uute ahelate sünteesi mallina.

Seega toimub amplikonide kuhjumine lahusesse vastavalt valemile 2", kus n on amplifikatsioonitsüklite arv. Seega, isegi kui alglahus sisaldas algselt ainult ühte kaheahelalist DNA molekuli, siis 30-40 tsükli jooksul ca. Lahusesse koguneb 108 amplikonimolekuli. See kogus on piisav selle fragmendi usaldusväärseks visuaalseks tuvastamiseks agaroosgeelelektroforeesiga.

Võimendusprotsess viiakse läbi spetsiaalses programmeeritavas termostaadis ( termotsükler), mis vastavalt etteantud programmile muudab automaatselt temperatuure vastavalt võimendustsüklite arvule.

Võimendamiseks on vaja järgmisi komponente:

· DNA maatriks(DNA või selle osa, mis sisaldab soovitud spetsiifilist fragmenti);

· Praimerid(sünteetilised oligonukleotiidid (20-30 nukleotiidipaari), mis on komplementaarsed DNA järjestustega määratud spetsiifilise fragmendi piiridel). Konkreetse fragmendi valik ja praimerite valik mängib amplifikatsiooni spetsiifilisuses kriitilist rolli, mis mõjutab analüüsi kvaliteeti.

· Deoksünukleotiidtrifosfaatide (dNTP) segu(segu neljast dNTP-st, mis on materjal uute komplementaarsete DNA ahelate sünteesiks ekvivalentsetes kontsentratsioonides 200–500 µM)

· EnsüümTaq- polümeraas(termostabiilne DNA polümeraas, mis katalüüsib praimerite ahelate pikenemist, lisades järjestikku nukleotiidaluseid sünteesitud DNA kasvavale ahelale, 2-3 mM).

· Puhverlahus(ensüümi aktiivsuse säilitamiseks vajalik Mg2+ ioone sisaldav reaktsioonikeskkond, pH 6,8-7,8).

RNA viiruste genoomi spetsiifiliste piirkondade tuvastamiseks saadakse esmalt RNA matriitsist DNA koopia, kasutades pöördtranskriptsiooni (RT) reaktsiooni, mida katalüüsib ensüüm revertaas (pöördtranskriptaas).

Riis. 2. Amplifikatsioon (1. tsükkel).

Riis. 3. Amplifikatsioon (2. tsükkel).

PCR peamised rakendused

· kliiniline meditsiin:

o infektsioonide diagnoosimine,

o mutatsioonide tuvastamine, sealhulgas pärilike haiguste diagnoosimine,

o genotüpiseerimine, sealhulgas HLA genotüpiseerimine,

o rakutehnoloogiad

· ökoloogia (keskkonnaobjektide ja toiduainete seisundi ja kvaliteedi jälgimise viis)

· transgeensete organismide (GMO) määramine

Isiku tuvastamine, isaduse tuvastamine, kohtuekspertiisi

· üld- ja spetsiifiline bioloogia,

Põhiprintsiibid

diagnostikalaborite organiseerimine

Töö PCR-laboris toimub vastavalt projekteerimisreeglitele, ettevaatusabinõudele, tööstuslikule kanalisatsioonile, epideemiavastasele režiimile ja isiklikule hügieenile tervishoiusüsteemi sanitaar- ja epidemioloogiaasutuste laborites (osakondades, osakondades) töötamisel.

DNA proovide saastumine

PCR-diagnostika läbiviimine on seotud probleemiga, mis on tingitud meetodi kõrgest tundlikkusest - võimalusest saastumine. Positiivse DNA jälgede (spetsiifilised DNA amplifikatsiooniproduktid – amplikonid; positiivse kontrollina kasutatav DNA standard; positiivne DNA kliinilisest proovist) sisenemine reaktsioonitorusse viib PCR-i käigus spetsiifilise DNA fragmendi amplifikatsioonini ja selle tulemusena. , välimusele valepositiivsed tulemused.

Töö käigus võib kokku puutuda kahte tüüpi saastumist:

1. ristsaastumine proovist proovini (kliiniliste proovide töötlemise ajal või reaktsioonisegu lahustamisel), mis põhjustab juhuslikke valepositiivseid tulemusi;

2. saastumine amplifikatsiooniproduktidega(amplikonid), mis on kõige olulisem, sest PCR protsessi käigus kogunevad amplikonid tohututes kogustes ja on ideaalsed tooted reamplifikatsiooniks.

Klaasnõude, automaatpipettide ja laboriseadmete, laboripinkide või isegi laboritöötajate nahapinna saastumine amplikonide jälgedega toob kaasa süstemaatilised valepositiivsed tulemused. Saasteallika kindlaksmääramine võib olla väga keeruline ning nõuab märkimisväärset aja- ja rahainvesteeringut. Senised kogemused diagnostikaks PCR-meetodit kasutavates laborites võimaldavad sõnastada põhinõuded selliste laborite töökorraldusele ja analüüside endi läbiviimisele. Nende nõuete järgimine välistab saastumise ja valepositiivsete tulemuste võimaluse.

PCR analüüsi etapid

Need on geograafiliselt eraldatud, paigutades need eraldi ruumidesse (joonis 4, 5):

· PCR-eelne ruum, kus töödeldakse kliinilisi proove, eraldatakse DNA, valmistatakse reaktsioonisegu PCR jaoks ja viiakse läbi PCR (tingimuste olemasolul on soovitatav läbi viia ka kaks viimast etappi täiendavas eraldi ruumis). Nendes ruumides on keelatud teha muid töid uuritavate ainetega, mille PCR diagnostika tehakse selles laboris.

· PCR-järgne tuba, kus tehakse amplifikatsiooniproduktide tuvastamine. Selles ruumis võib kasutada muid tuvastamismeetodeid. Soovitatav on paigutada amplifikatsiooniproduktide tuvastamise ruum PCR-eelsetest ruumidest võimalikult kaugele.

Tööruumid on varustatud ultraviolettlampidega, mille maksimaalne kiirgus on umbes 260 nm (tüüp DB-60) kiirusega 2,5 W 1 m3 kohta. Lambid paiknevad nii, et töölaudade, seadmete ja materjalide pinnad, millega operaator PCR-analüüsi ajal kokku puutub, puutuvad kokku otsese kiirgusega. Kiiritus viiakse läbi 1 tunni jooksul enne töö alustamist ja 1 tunni jooksul pärast töö lõpetamist.

Laboriarstid töötavad spetsiaalses laboririietuses, mida ühest ruumist teise liikudes vahetatakse, ja ühekordsetes kinnastes. Erinevate ruumide riided töödeldakse eraldi. Erinevad töötajad töötavad PCR analüüsi erinevatel etappidel.

Tööks kasutatakse eraldi dosaatorite, plast- ja klaasnõude komplekte, laborivarustust, hommikumantleid ja kindaid, mis on ette nähtud analüüsi erinevateks etappideks ja ei ole ühest ruumist teise kaasaskantavad. Igas ruumis olevad seadmed, materjalid ja tarvikud on asjakohaselt märgistatud.

Kõik tööetapid tehakse ainult ühekordselt kasutatavate kulumaterjalidega: automaatpipettide otsikud, katseklaasid, kindad jne. Proovilt proovile liikudes vahetage kindlasti otsikuid. Vajalik on kasutada filtriga otsikuid – aerosoolbarjääri, et vältida lahuse mikrotilkade sattumist pipetti. Kasutatud torud ja otsikud visatakse spetsiaalsetesse konteineritesse või konteineritesse, mis sisaldavad desinfitseerimislahust. Kliinilisi proove hoitakse reagentidest eraldi.

Töökoha töötlemiseks ja puhastamiseks on iga ruum varustatud vati-marli tampoonide (lappide), pintsettide, desinfitseerivate ja inaktiveerivate lahustega.

PCR diagnostikalabor välistab selles laboris diagnoositud patogeenide DNA järjestusi või geenifragmente sisaldavate rekombinantsete plasmiidide tootmise (kloonimise) ja isoleerimisega seotud tööd.

Kliinilise materjali kogumine

PCR-i jaoks uuritav materjal võib olla epiteelirakkude, vere, plasma, seerumi, pleura- ja seljaajuvedelike, uriini, röga, lima ja muude bioloogiliste eritiste kaabitsad, biopsiad.

Materjal kogutakse vastava profiiliga raviruumis. Pärast kogumist tuleb proovid võimalikult kiiresti toimetada PCR-i diagnostikalaborisse.

Proove tuleb võtta steriilsete, eelistatavalt ühekordselt kasutatavate instrumentidega, ainult ühekordselt kasutatavates steriilsetes plasttorudes või klaastorudes, eelnevalt töödeldud tund aega kroomiseguga, pesta põhjalikult destilleeritud veega ja kaltsineerida kuivatuskapis temperatuuril 150 °C. 1 tunniks.

Tuvastamistsoon (teine korrus või teine hoone).

Riis. 4. PCR laboriseade elektroforeesiga tuvastamisega.

Tuvastamistsoon (teine korrus või teine hoone)

Riis. 5. PCR laboriseade fluorestsentstuvastusega (kvantitatiivne analüüs).

Riis. 6. DNA ekstraheerimise ruum. Näidatud on bakteritsiidse lambiga lauakarp.

Riis. 7. Võimendusruum.

Riis. 8. Tuvastamisruum.

Riis. 9. Vereproovid pärilike haiguste DNA diagnostikaks.

Proovide ladustamine ja transport

Pärilike haiguste diagnoosimiseks säilitatakse vereproovid spetsiaalsetel pabervormidel või epindorfides (plasttorudes) pikka aega külmutatuna (joon. 9).

Nakkushaiguste diagnoosimiseks hoitakse proove toatemperatuuril mitte rohkem kui 2 tundi. Kui on vaja pikemat säilitamist, võib proove panna külmikusse temperatuuril 2–8°C kuni ööpäevaks. Pikem säilitamine (kuni 2 nädalat) on lubatud sügavkülmas külmutatult temperatuuril miinus 20°C. Proovide korduv külmutamine ja sulatamine ei ole lubatud.

Kui PCR diagnostikalabor ja ravituba proovide võtmiseks on geograafiliselt eraldatud, siis tuleks proovide transportimine läbi viia termostes või termilistes konteinerites, järgides proovide säilitamise eeskirju ja nakkusohtlike materjalide transportimise eeskirju.

DNA ekstraheerimine proovidest

Levinud on tahkefaasiline sorptsioonimeetod, mis seisneb guanidiinilahust sisaldava lüüsiaine lisamises, DNA sorptsioonis sorbendil, korduvas pesemises ja DNA resorptsioonis puhverlahusega. Seerumi, plasma või täisvere töötlemisel kasutatakse tavaliselt fenooli ekstraheerimise meetodit. Meetod hõlmab deproteiniseerimist fenooli/kloroformiga, millele järgneb DNA (või RNA) sadestamine etanooli või isopropanooliga. Töötlemine toimub Eppendor P mikrotsentrifuugi katseklaasides mahuga 1,5 ml. Töötlemisaeg on 1,5-2 tundi (joon. 10).

Riis. 10. DNA ekstraheerimine.

PCR läbiviimine

Teatud kogus töödeldud kliinilisest proovist kantakse spetsiaalsesse Eppendorfi tüüpi mikrotsentrifuugi tuubi mahuga 0,2 või 0,5 ml. Lisatakse amplifikatsioonisegu, mis koosneb veest, PCR puhvrist, dNTP lahusest, praimeri lahusest ja lahusest. sama tuubi (lisatakse segule viimasena) Tavaliselt on reaktsioonisegu maht 25 μl Seejärel lisatakse igasse katsutisse üks tilk mineraalõli, et vältida reaktsioonisegu aurustumist amplifitseerimisprotsessi käigus kantakse üle programmeeritavale termostaadile (võimendile), kus võimendamine toimub automaatselt vastavalt etteantud programmile (joon. 11).

Riis. üksteist. Võimendi" Termoratas ».

Reaktsiooniaeg, olenevalt määratud programmist, on 2-3 tundi. Paralleelselt katseproovidega paigutatakse kontrollproovid: positiivne kontroll sisaldab kõiki reaktsiooni komponente, kuid kliinilise proovimaterjali asemel lisatakse uuritava geeni kontroll-DNA preparaat. Negatiivne kontroll sisaldab kõiki reaktsiooni komponente, kuid kliinilise materjali või DNA preparaadi asemel lisatakse sobiv kogus deioniseeritud vett või ekstrakti, mis ei sisalda testitavat DNA-d. Negatiivne kontroll on vajalik, et kontrollida reaktsioonikomponentide DNA puudumist saastumise tõttu ja välistada valepositiivsed tulemused.

Tulemuste registreerimine

Amplifitseeritud spetsiifiline DNA fragment tuvastatakse agaroosgeelelektroforeesiga etiidiumbromiidi juuresolekul. Etiidiumbromiid moodustab DNA fragmentidega stabiilse interstitsiaalse ühendi, mis ilmneb helendavate ribadena, kui geeli kiiritatakse UV-kiirgusega lainepikkusega 290-330 nm. Olenevalt PCR tulemusena moodustunud amplikonide suurusest kasutatakse geeli, mille agaroosisisaldus on 1,5% kuni 2,5%. Agaroosgeeli valmistamiseks sulatatakse agaroosi, puhvri ja vee segu mikrolaineahjus või veevannis ning lisatakse etiidiumbromiidi lahus. Temperatuurini 50-60°C jahutatud segu valatakse vormi 4-6 mm paksuse kihina ning spetsiaalsete kammide abil tehakse geelisse proovi pealekandmiseks taskud. Kammid paigaldatakse nii, et süvendite põhja ja geeli põhja vahele jääb 0,5-1 mm kiht agaroosi. Pärast geeli kõvenemist kantakse võimendi taskutele koguses 5-15 μl. Paralleelselt kontroll- ja katseproovidega on soovitatav läbi viia DNA fragmendi pikkuse markerite segu elektroforees. Tavaliselt sisaldab selline segu kümmet DNA fragmenti pikkusega 100, 200, 300 jne aluspaari.

Sellise testi kasutamine võimaldab kontrollida amplikonide pikkust kontroll- ja katseproovides. Geel koos pealekantud prooviga kantakse puhvriga täidetud elektroforeesikambrisse, kamber ühendatakse toiteallikaga ning amplifikatsiooniproduktide elektroforeetiline eraldamine toimub 30-45 minuti jooksul elektrivälja tugevusega 10-15 V/ cm. Sel juhul peab reaktsioonisegus sisalduva värvaine esiosa ulatuma vähemalt 3 cm.

Pärast elektroforeesi lõppu kantakse geel klaasist transilluminaatorisse ja vaadeldakse ultraviolettvalguses. Dokumenteerimiseks pildistatakse geel Micrat 300 filmile või salvestatakse arvutiga ühendatud videosüsteemi abil.

Kõigepealt hinnatakse kontrollproove. Positiivsele kontrollile vastavas elektroforeesirajas peaks olema oranž helendav riba. Selle elektroforeetiline liikuvus peab vastama juhistes määratud amplikoni pikkusele.

Negatiivsele kontrollile vastavas elektroforeesirajas peaks selline riba puuduma. Sellise riba olemasolu negatiivses kontrollis viitab saastumisele – kasutatud reaktiivide saastumisele testitava DNA või amplikoniga. Uuritavaid proove hinnatakse riba olemasolu järgi vastaval rajal, mis asub positiivse kontrollproovi ribaga samal tasemel. Riba intensiivsus vastab proovis testitava DNA kogusele, mis võimaldab PCR-i poolkvantitatiivselt hinnata. Tavaliselt positiivseid tulemusi hinnatud nelja palli skaalal. Kui testitava proovi riba kuma on väga nõrk, tuleks selline näidis ümber paigutada (joonis 12).

Riis. 12. Agaroosgeeli elektroforees.

PCR rakendusedpunktmutatsioonide ja geenipolümorfismide diagnostika

Üks juhtivaid PCR rakendusvaldkondi praktilises tervishoius on punktmutatsioonide ja geenipolümorfismide diagnoosimine. . On olemas otsesed ja kaudsed DNA diagnostika meetodid. Olukordades, kus on teada geen, mille kahjustus viib päriliku haiguse väljakujunemiseni, saab seda kahjustust tuvastada molekulaargeneetiliste meetoditega. Selliseid meetodeid nimetatakse otsesteks. Otseste meetoditega tuvastatakse ebakorrapärasused DNA primaarses nukleotiidjärjestuses (mutatsioonid ja nende tüübid). Otseseid meetodeid iseloomustab täpsus, mis ulatub peaaegu 100% -ni.

Kuid praktikas saab neid meetodeid teatud tingimustel kasutada:

· päriliku haiguse tekke eest vastutava geeni teadaoleva tsütogeneetilise lokaliseerimisega;

· haiguse geen peab olema kloonitud ja selle nukleotiidjärjestus teada.

DNA otsese diagnostika eesmärk on tuvastada mutantseid alleele.

Seega, olukordades, kus on teada, milline DNA kahjustus viib päriliku haiguseni, uuritakse kahjustust sisaldavat DNA fragmenti otse ehk kasutatakse DNA otsediagnostilist meetodit.

Tänaseks on aga paljude haiguste geenid kaardistamata, nende eksonintroni korraldus on teadmata ning paljusid pärilikke haigusi iseloomustab väljendunud geneetiline heterogeensus, mis ei võimalda DNA otseseid diagnostikameetodeid täiel määral kasutada. Seetõttu kasutatakse juhtudel, kui kahjustuse lokaliseerimine on teadmata, teist lähenemisviisi, mis on seotud geenihaiguse eest vastutava geeni läheduse uurimisega, kombineerituna pereanalüüsiga, st kaudsete molekulaargeneetilise diagnoosimise meetoditega. kasutatakse pärilikke haigusi.

Punktmutatsioonide ja väikeste deletsioonide tuvastamiseks saab kasutada erinevaid meetodeid, kuid need kõik põhinevad PCR meetodil. See reaktsioon võimaldab teil DNA nukleotiidjärjestust mitu korda korrutada ja seejärel mutatsioone otsida. Mutatsioone kandvate DNA fragmentide otsimise meetodid põhinevad võrdlev analüüs mutantsed ja normaalsed DNA nukleotiidjärjestused.

PCR-produktide analüüs

otsese DNA diagnostika protsessis

Hõlmab amplifitseeritud geenipiirkonna spetsiifiliste tunnuste uurimist. Seega on trinukleotiidi korduste laienemisest põhjustatud haiguste korral erinevad amplifikatsiooniproduktid oma pikkuse (peegeldab erinevat triplettide arvu uuritavas geenipiirkonnas) ja sellest tulenevalt ka liikumiskiiruse poolest geelis. Tänu sellele saavutatakse normaalsete ja mutantsete alleelide selge elektroforeetiline eraldamine ning patoloogiliselt pikliku fragmendi täpne määramine, st haiguse DNA-diagnoos (joon. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Riis. 14. Kustutamise diagnoos GAG geenis DYT 1 dopa-sõltumatu düstooniaga patsientidel (polüakrüülamiidgeelelektroforees). Rajad 2,3,6 – haige; rajad 1,4,5 – kontroll. Õhuke nool tähistab normaalset alleeli, paks nool tähistab mutantset lühemat alleeli (kolme nukleotiidi deletsioon).

Kui kogu uuritav DNA piirkond on osa laiendatud deletsioonist, siis praimeri hübridisatsioonikohtade puudumise tõttu ei teostata selle kustutatud alleeli DNA PCR-i amplifikatsiooni. Sel juhul diagnoositakse homosügootne deletsioon PCR reaktsiooniprodukti täieliku puudumise põhjal (DNA süntees on geeni mõlemast koopiast võimatu). Heterosügootse deletsiooniga on võimalik tuvastada normaalsest (säilinud) alleelist sünteesitud PCR-produkti, kuid sellise mutatsiooni usaldusväärseks diagnoosimiseks on vaja kasutada keerukamaid DNA kuvamismeetodeid, mis võimaldavad hinnata lõpliku PCR-i annust; toode.

Punktmutatsioonide (kõige sagedamini nukleotiidide asenduste) tuvastamiseks teatud kohtades kasutatakse PCR-meetodit koos teiste molekulaargeneetilise analüüsi meetoditega. Kui oletatava punktmutatsiooni asukoht ja olemus on täpselt teada, siis restriktsiooni endonukleaasid (restriktsiooniensüümid) on spetsiaalsed rakulised ensüümid, mis on eraldatud erinevatest bakteritüvedest.

Need ensüümid tunnevad ära spetsiifilised nukleotiidjärjestused, mille pikkus on vahemikus neli kuni kümme nukleotiidi. Pärast seda viiakse läbi nende järjestuste restriktsioon (lat. (lõikamine)) kaheahelalise DNA molekuli osana. Iga restriktsiooniensüüm tunneb ära ja lõikab kindlas kohas ära rangelt määratletud spetsiifilise nukleotiidjärjestuse. piirangusait (tuvastuskoht).

Juhtudel, kui punktmutatsioon muudab teatud restriktsiooniensüümi loomulikku äratundmiskohta, ei suuda see ensüüm mutantset PCR-ga amplifitseeritud fragmenti lõhustada. Mõnel juhul põhjustab mutatsioon konkreetse restriktsiooniensüümi jaoks uue äratundmissaidi, mis tavaliselt puudub.

Mõlemas olukorras toodavad valitud restriktsiooniensüümiga töödeldud mutantsed ja normaalsed PCR produktid erineva pikkusega restriktsioonifragmente, mida saab kergesti tuvastada elektroforeesiga (joonis 15).

Seega, kui on vaja kiiresti tuvastada mõni konkreetne punktmutatsioon, taandub ülesanne vastava restriktsiooniensüümi otsimisele, mille äratundmissait paikneb katkenud nukleotiidjärjestuse kohas. PCR-produktide töötlemine sellise restriktsiooniensüümiga võimaldab hõlpsasti eristada normaalseid ja mutantseid alleele. Restriktsioonianalüüs lihtsustab oluliselt teadaolevate punktmutatsioonide tuvastamist ja seda kasutatakse nüüd laialdaselt pärilike haiguste otseseks DNA diagnoosimiseks.

Viimane etapp mutatsioonide molekulaargeneetiline analüüs on uuritava DNA fragmendi nukleotiidjärjestuse määramine (sekveneerimine), mida võrreldakse normiga ja koostatakse lõplik geneetiline diagnoos. Tänu molekulaargeneetika edusammudele on tänaseks välja töötatud DNA diagnostikameetodid enam kui 400 päriliku haiguse jaoks.

Riis. 15. Punktmutatsiooni tuvastamine restriktsioonianalüüsi abil: A – amplifitseeritud geenipiirkond, mis sisaldab restriktsioonisaitiAGCTrestriktsiooni endonukleaasi jaoksAlu I. MutatsioonG→ Amuudab seda nukleotiidjärjestust, mille tulemuseks on restriktsiooniensüümAluIblokeeritud; B – restriktsiooniproduktide elektroferogramm: rada 1 – homosügootsus normaalse alleeli suhtes; rada 2 – homosügootsus mutatsiooni jaoks; rada 3 – heterosügootne seisund (normaalne alleel + mutatsioon).

Pärilike haiguste diagnoosimine, mis põhineb mutantsete alleelide otsesel uurimisel patsientidel, nende pereliikmetel või patoloogiliste mutatsioonide kahtlustatavatel heterosügootsetel kandjatel, sobib pre-sümptomaatiliseks ja sünnieelseks diagnoosimiseks, mida saab rakendada loote arengu kõige varasemates staadiumides, enne sünnitust. haiguste kliiniliste või biokeemiliste sümptomite ilmnemine.

Olenemata mutatsiooni tuvastamise meetodist saab iga mutatsiooni täpseid molekulaarseid omadusi saada ainult otsese sekveneerimisega. Selle protsessi automatiseerimiseks on viimastel aastatel laialdaselt kasutatud spetsiaalseid seadmeid - sekvensereid, mis võimaldavad oluliselt kiirendada DNA teabe lugemist.

Võimalus rohkemaks lai rakendus molekulaarbioloogilised uuringud kliinilistes diagnostikalaborites avavad analüütilise protsessi kiirendamise, tehes kõik protseduurid ühes kontiinumis, ilma proovi ülekandmiseta, luues tingimused saastumise vältimiseks mitmete analüütide paralleelsel testimisel ja tulemuste objektiivse registreerimisega igas tsüklis.

PCR-meetodi peamised modifikatsioonid

Kasutatakse teadaolevate geenimutatsioonide kiireks skannimiseks ja otsimiseks.

Multipleksne (multipraimer) PCR

See meetod põhineb uuritava geeni mitme eksoni samaaegsel võimendamisel ühes reaktsioonis. See võimaldab kuluefektiivset kiiret kõige levinumate mutatsioonide sõelumist. Näiteks progresseeruva Duchenne/Beckeri lihasdüstroofiaga patsientidel düstrofiini geeni deletsioonide kandmise kiireks diagnoosimiseks viiakse läbi selle geeni kõige sagedamini muteerunud eksonite komplekti samaaegne amplifikatsioon. Kuna need haigused on päritud X-seotud retsessiivsel viisil ja neid seostatakse poiste ainsa X-kromosoomi kahjustusega, siis pikendatud deletsiooni korral näitab reaktsiooniproduktide elektroforees ühe või mitme DNA fragmendi (eksoni) puudumist. ), mis võib olla diagnoosi molekulaarne kinnitus. Lisaks on PCR-i amplifikatsiooniks spetsiifiliste geenilõikude valimisel võimalik deletsiooni ja geeni murdepunktide kogupikkuse (kuni eksoni) üsna täpne hinnang.

Mitme multipleksreaktsiooni kombineeritud kasutamine võimaldab diagnoosida kuni 98% kõigist progresseeruva Duchenne/Beckeri lihasdüstroofiaga patsientidel esinevatest deletsioonidest. See moodustab ligikaudu 60% teadaolevate mutatsioonide koguarvust düstrofiini geenis ja näitab selle sõelumismeetodi väga suurt efektiivsust düstrofinopaatiate DNA diagnoosimisel (joonis 16).

Riis. 16. Duchenne'i lihasdüstroofia otsene DNA-diagnoos, kasutades multipleks-PCR-i (agaroosgeelelektroforees). Igas uuritud isikus amplifitseeriti samaaegselt neli düstrofiini geeni eksonit (eksonid 17, 19, 44 ja 45; nooled näitavad vastavaid amplifikatsiooniprodukte). Rada 1 – kontroll, rajad 2–5 – Duchenne’i lihasdüstroofiaga patsiendid, kellel on düstrofiini geeni mitmesugused deletsioonid (rajad 2 ja 5 – eksoni 45 deletsioon, rada 3 – eksoni 44 deletsioon, rada 4 – eksonite 17 ja 19 deletsioon ).

Alleelispetsiifiline amplifikatsioon

Meetod põhineb kahe sõltumatu praimeripaari kasutamisel konkreetse geenipiirkonna jaoks: üks praimer mõlemas paaris on ühine ja teine praimer igas paaris on erineva struktuuriga ja on komplementaarne kas normaalse või mutantse DNA järjestusega. Sellise reaktsiooni tulemusena saab lahuses sünteesida samaaegselt kahte tüüpi PCR-produkte - normaalseid ja mutantseid. Veelgi enam, kasutatavate praimerite disain võimaldab selgelt eristada normaalseid ja mutantseid amplifikatsiooniprodukte nende molekulaarse suuruse järgi. See meetod on väga visuaalne ja võimaldab teil kontrollida mutantse alleeli nii homo- kui ka heterosügootset kandmist.

Meetod amplifitseeritud DNA saidipõhiseks muutmiseks

Meetod põhineb nn mittesobiva praimeri kasutamisel PCR-is (pole täielikult komplementaarne matriitsiga), mis erineb matriitsi DNA järjestusest ühe nukleotiidi võrra. Määratud praimeri lisamise tulemusena mutantsesse PCR-produkti moodustub selles ühe restriktsiooniendonukleaasi jaoks kunstlikult loodud restriktsioonisait, mis võimaldab restriktsioonianalüüsi abil otsest DNA-diagnoosi teatud teadaoleva mutatsiooni kohta. Sellise kunstliku restriktsioonisaidi loomine on vajalik, kui otsing ei tuvastanud teadaoleva ja kättesaadava ensüümi olemasolu, mille "looduslikku" restriktsioonisaiti mõjutab uuritava mutatsiooni ilmnemine DNA molekulis. .

Pöördtranskriptaasi PCR meetod (RT- PCR)

Seda meetodit kasutatakse juhtudel, kui uurimisobjektina on mugavam kasutada mitte genoomset DNA-d, vaid kompaktsemat ja teaberikkamat cDNA-d, mis on saadud pärast koeproovide, näiteks biopsia materjali või lümfotsüütide rakuliinide, sobivat töötlemist, fibroblastid jne. Oluline tingimus siin on soovitud geeni ekspressioon (vähemalt minimaalne) uuritavas koes.

Esimeses etapis viiakse läbi mRNA pöördtranskriptsioon ja saadud cDNA molekulid toimivad PCR-i matriitsina. Seejärel teostatakse piisavas koguses amplifitseeritud cDNA kriitiline piirkond sekveneerimise ja muude mutatsioonide skriinimise, otsese elektroforeetilise uuringu (deletsioonide, insertsioonide jne tuvastamine) või ekspressioonisüsteemi integreerimise meetoditega, et saada valguprodukt. ja selle otsene analüüs.

See meetod on eriti tõhus "kärbitud" valgu sünteesini viivate mutatsioonide (nonsenssmutatsioonid, splaissimismutatsioonid, suured deletsioonid) tuvastamiseks - nn PTT analüüs (valgu kärpimise test). PTT-analüüsi kasutatakse tavaliselt pikkade mitme eksoni geenide, näiteks Duchenne'i / Beckeri lihasdüstroofia, ataksia-telangiektaasia või 1. tüüpi neurofibromatoosi uurimisel.

Reaalajas PCR(Reaalajas PCR, inglise keel)

Igal aastal on reaalajas PCR muutumas praktilises tervishoius üha populaarsemaks diagnostikameetodiks. Selle põhiomaduseks on polümeraasi ahelreaktsiooni produktide akumuleerumise jälgimine ja kvantitatiivne analüüs ning saadud tulemuste automaatne registreerimine ja tõlgendamine. See meetod ei nõua elektroforeesi etappi, mis vähendab PCR-labori nõudeid. Tänu tootmispinna kokkuhoiule, personali arvu ja nõudluse vähendamisele kvantifitseerimine DNA/RNA seda meetodit on viimastel aastatel edukalt kasutatud maailma arenenud riikide suurimates sanitaar-epidemioloogilistes, diagnostika- ja uurimiskeskustes, asendades PCR-i selle praeguses (“klassikalises”) vormingus.

Reaalajas PCR kasutab fluorestseeruvalt märgistatud oligonukleotiidsonde, et tuvastada DNA amplifitseerimisel. Reaalajas PCR võimaldab proovi täielikku analüüsi 20-60 minuti jooksul ja on teoreetiliselt võimeline tuvastama proovis isegi ühe DNA või RNA molekuli.

Riis. 17. Reaalajas PCR.

Reaalajas PCR kasutab TaqMani süsteemi, mis kontrollib PCR kineetikat otse amplifikatsiooni ajal, kasutades resonantsfluorestsentsi kustutamist. Tuvastamiseks kasutatakse sondi, mis kannab fluorofoori ja summutajat, mis on komplementaarsed amplifitseeritud fragmendi keskosaga. Kui fluorofoor ja kustutaja on seotud oligonukleotiidsondiga, täheldatakse ainult väikest fluorestseeruvat emissiooni. Tänu Taq polümeraasi 5" eksonukleaasi aktiivsusele läheb fluorestseeruv märgis amplifikatsiooniprotsessi ajal lahusesse, vabaneb selle lähedusest kustutajaga ja genereerib fluorestsentssignaali, mis suureneb reaalajas võrdeliselt võimendi akumuleerumisega ( joonis 17).

Reaalaja PCR peamised eelised geelelektroforeesiga PCR ees:

· Kogu meetod toimub ühes katseklaasis;

· Meetod võtab aega 1 tund;

· Piisab 1-2 tööruumist;

· Koos tulemuse kvalitatiivse hindamisega ilmneb kvantitatiivse hindamise võimalus (näiteks retsepti väljakirjutamisel viirusevastane ravi AIDSi või viirushepatiidi puhul on vaja teada viiruskoormust, st viiruse kogust ühiku kohta, mille annab reaalajas PCR);

· Saastumise oht on järsult vähenenud.

Järeldus

PCR-meetod on üks levinumaid molekulaarbioloogiliste uuringute meetodeid. Arstid peaksid seda meetodit arukalt kasutama ning arstil, kes otsustab oma töös kasutada PCR-i, peab olema teatud teadmised selle meetodi omaduste ja võimaluste kohta. Teiseks peab kliiniku ja PCR labori vahel olema tihe suhe. Tagasiside vajalik keeruliste juhtumite analüüsimiseks ja õige diagnostikastrateegia väljatöötamiseks. Kolmandaks, PCR-analüüs ei ole imerohi diagnoosimisel (peamiselt nakkushaigused) ega asenda olemasolevaid meetodeid vaid täiendab seda. Ja mis kõige tähtsam, PCR ei saa asendada intuitsiooni ja analüütilist mõtlemist, mis edu ootaval arstil peab olema.

P . S . Molekulaarbioloogilised uuringud – diagnoosi ja ravi juhiste muutmine. Molekulaarbioloogiliste meetodite kasutamine on seotud laboridiagnostika rõhuasetuse radikaalse muutuse väljavaatega. See ei pruugi tähendada ainult õigeaegset teavet, vaid selle ette saamist. Kui nüüd laboriuuringud Enamasti tehakse neid siis, kui haigus on juba välja kujunenud ja ravi alanud, siis eeldatakse, et molekulaarbioloogilise laboratoorse teabe põhjal on võimalik kindlaks teha inimese kalduvus teatud tüüpi patoloogiatele ja tundlikkuse aste teatud ravimite suhtes, mis õigustab tulevikumeditsiini ennustavat, ennetavat ja isikupärastatud olemust.

DIAGNOOSI JA RAVI ORIENTATSIOONIDE MUUTAMINE

PÄRILIKUD HAIGUSED

Täna Tulevikus

Diagnoos Geneetiline pass

8. Mitu tööruumi on vaja fluorestsentstuvastusega (kvantitatiivne analüüs, reaalajas PCR) PCR labori tööks?

9. Mis on tuvastamine?

10. Millised DNA diagnostika meetodid on olemas?

11. Millise ensüümi töö on PCR aluseks?

12. Miks tuleb tuvastamistsoon teistest tööpiirkondadest eemaldada?

13. Mis on piirangusait?

14. Millised on otsese ja kaudse DNA diagnostikameetodite erinevused?

15. Mis on järjestamine?

16. Mis on multipleksne PCR?

17. Mis tüüpi mutatsioonid määratakse PCR abil?

18. Mis on saastumine?

19. Mis on alleelispetsiifilise amplifikatsioonimeetodi olemus?

20. PCR materjali säilitustingimused?

21. Millises seadmes toimub võimendamine?

22. Mis on pöördtranskriptaasi PCR (RT-PCR) meetod?

23. Mis on PCR-diagnostika materjaliks?

24. Loetlege saastetüübid?

Enese ettevalmistamise testid

1. Endonukleaasi restriktsiooniensüümid:

a) ensüümid, mis "murdavad" DNA-d rangelt kindlates kohtades;

b) ensüümid, mis kokku õmblevad, lõhuvad DNA molekulis;

c) ensüümid, mis annavad ühendeid, mis teostavad DNA parandamist.

2. Geeni võimendamine:

3. Millist molekulaargeneetika meetodit kasutatakse teadaoleva järjestusega mutantse geeni põhjustatud haiguste diagnoosimiseks?

a) spetsiifilise restriktsiooniensüümi kasutamine;

b) otsene tuvastamine, kasutades spetsiifilisi molekulaarsonde;

c) normaalse restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismide jaotuse perekondlik analüüs.

4. DNA sekveneerimine:

a) DNA alusjärjestuse identifitseerimine;

b) mis tahes DNA lõigu mitu kordamist;

c) uuritavat geeni sisaldava DNA fragmendi eraldamine.

5. DNA proovide saamiseks võite kasutada :

b) koorioni villid;

c) lootevesi;

d) lootevee rakud;

e) naha, lihaste, maksa biopsiaproovid,

e) kõik on õige, välja arvatud punkt “c”,

g) kõik on õige, välja arvatud punkt “d”,

h) kõik eelnev on tõsi.

6. PCR-meetodit kasutatakse mutatsioonide diagnoosimiseks:

a) genoomne;

b) kromosomaalne;

c) geen (punkt).

7. Praimer on:

a) DNA komplementaarne osa;

b) sünteetiline oligonukleotiidiga märgistatud (radioaktiivselt või fluorestseeruvalt) järjestus, mis on komplementaarne mutantse või normaalse geeniga;

c) oligonukleotiid, mis toimib "praimerina" ja käivitab polünukleotiidahela sünteesi DNA või RNA maatriksil.

8. Kes töötas välja PCR-meetodi põhimõtte?

b) K. Mullis

9. Kas PCR-meetodit kasutatakse trinukleotiidi korduste laienemise (dünaamiline mutatsioonitüüp) diagnoosimiseks?

10. Millistes valdkondades PCR-i kasutatakse?

a) kliiniline meditsiin;

b) transgeensete organismide (GMO) määramine

c) isikutuvastus, isaduse tuvastamine, kohtuekspertiisi

d) kõik ülaltoodu,

e) mitte ükski ülaltoodust.

Vastuste näidised: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – sisse; 7 – sisse; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Peamine

1.Botškovi geneetika. Moskva. GEOTAR, 2002.

Lisaks

1. , Bakharev ja laste kaasasündinud ja pärilike haiguste ravi. - Moskva, 2004.

2. DNA diagnostika ja meditsiinigeneetiline nõustamine. - Moskva, 2004.

3. Gintergeneetika. - Moskva, 2003.

4. Gorbunov meditsiinigeneetika alused. – Peterburi: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekulaarne kliiniline diagnostika. – Maailm, 1999.

6. Menšikov - bioloogilised uuringud kliinilises laboratoorses diagnostikas: probleemi võimalused (loengud). Kliiniline laboratoorne diagnostika, № 3, 2006.

7. Kornienko töö PCR laboris bioloogilise materjali in-line analüüsi käigus. Kliiniline laboridiagnostika, nr 10, 2006.

8. PCR laboritöö korraldus. Metoodilised juhised. MU 1.3.1794-03. Vene Föderatsiooni peasanitararst, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnoloogia. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Reaalajas kvantitatiivne PCR. Genome Res. – nr 6, 1996.

MEETOD PÕHIPÕHIMÕTTED

POLÜMERAASI KETREAKTSIOON

Üldmeditsiini (060101) ja pediaatria (060103) erialade 3-4-aastaste üliõpilaste klassivälise töö metoodiline juhend.

Riiklik kutsealane kõrgharidusasutus "Föderaalse Tervise- ja Sotsiaalarengu Agentuuri Krasnojarski Riiklik Meditsiiniakadeemia"

Venemaa, Krasnojarsk,

1. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

2. Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhimõte

2.1 Mitmete komponentide olemasolu reaktsioonisegus

2.2 Tsükliline temperatuurirežiim

2.3 Praimerite valimise põhiprintsiibid

2.4 Platooefekt

3. PCR etapid

3.2 Võimendamine

3.4.1 Positiivsed juhtelemendid

3.4.2 Sisekontroll

4.1 Kvalitatiivne analüüs

4.1.2 RNA molekulide tuvastamine

3.1 Bioloogilise proovi valmistamine

DNA kasutamise eraldamiseks erinevaid tehnikaid olenevalt määratud ülesannetest. Nende olemus seisneb DNA ekstraheerimises (ekstraheerimises) bioloogilisest preparaadist ja võõrlisandite eemaldamises või neutraliseerimises, et saada PCR jaoks sobiva puhtusega DNA preparaat.

Marmuri kirjeldatud puhta DNA preparaadi saamise meetodit peetakse standardseks ja see on juba muutunud klassikaliseks. See hõlmab ensümaatilist proteolüüsi, millele järgneb valgu eemaldamine ja DNA ümbersadestamine alkoholiga. See meetod võimaldab teil saada puhta DNA preparaati. See on aga üsna töömahukas ja hõlmab töötamist selliste agressiivsete ja tugevalt lõhnavate ainetega nagu fenool ja kloroform.

Üks praegu populaarseid meetodeid on DNA ekstraheerimise meetod, mille on välja pakkunud Boom jt. See meetod põhineb tugeva kaotroopse aine, guanidiintiotsüanaadi (GuSCN) kasutamisel rakkude lüüsiks ja sellele järgnevaks DNA sorptsiooniks kandjal (klaashelmed, kobediatomiit, klaaspiim jne). Pärast pesemist jääb DNA proovi, sorbeerituna kandjale, kust see on elueerimispuhvri abil kergesti eemaldatav. Meetod on mugav, tehnoloogiliselt arenenud ja sobib proovi ettevalmistamiseks amplifikatsiooniks. Kuid DNA kadu on võimalik kandjal pöördumatu sorptsiooni tõttu, aga ka arvukate pesemiste käigus. See on eriti oluline proovis väikese koguse DNA-ga töötamisel. Lisaks võivad isegi väikesed GuSCN-i kogused pärssida PCR-i. Seetõttu on selle meetodi kasutamisel väga oluline õige valik sorbent ja tehnoloogiliste nüansside hoolikas järgimine.

Teine proovide ettevalmistamise meetodite rühm põhineb Chilexi tüüpi ioonivahetite kasutamisel, mis erinevalt klaasist ei sorbeeri DNA-d, vaid pigem reaktsiooni segavaid lisandeid. Reeglina sisaldab see tehnoloogia kahte etappi: proovi keetmine ja lisandite sorptsioon ioonivahetil. Meetod on selle teostamise lihtsuse tõttu äärmiselt atraktiivne. Enamasti sobib see kliinilise materjaliga töötamiseks. Kahjuks on mõnikord proovides lisanditega, mida ei saa ioonivahetitega eemaldada. Lisaks ei saa mõningaid mikroorganisme lihtsalt keetmisega hävitada. Nendel juhtudel on vaja sisse viia proovi töötlemise täiendavad etapid.

Seega tuleks proovi ettevalmistamise meetodi valikut arvesse võtta kavandatud analüüsi eesmärkide mõistmisel.

3.2 Võimendamine

Amplifikatsioonireaktsiooni läbiviimiseks on vaja valmistada reaktsioonisegu ja lisada sellele analüüsitud DNA proov. Oluline on võtta arvesse praimeri lõõmutamise mõningaid omadusi. Fakt on see, et analüüsitud bioloogiline proov sisaldab reeglina erinevaid DNA molekule, millega reaktsioonis kasutatud praimerid on osalise ja mõnel juhul olulise homoloogiaga. Lisaks võivad praimerid üksteisega liituda, moodustades praimerite dimeere. Mõlemad põhjustavad kõrvalsaaduste (mittespetsiifiliste) reaktsioonisaaduste sünteesimiseks kasutatavate praimerite märkimisväärset kulu ja selle tulemusena vähendavad oluliselt süsteemi tundlikkust. See muudab reaktsioonitulemuste lugemise elektroforeesi ajal keeruliseks või võimatuks.

3.3 Reaktsioonitulemuste hindamine

PCR-i tulemuste õigeks hindamiseks on oluline mõista, et see meetod ei ole kvantitatiivne. Teoreetiliselt saab üksikute sihtmärk-DNA molekulide amplifikatsiooniprodukte tuvastada elektroforeesi abil 30-35 tsükli järel. Praktikas tehakse seda aga vaid juhtudel, kui reaktsioon toimub ideaalilähedastes tingimustes, mida elus sageli ei juhtu. Eriti suur mõju Amplifikatsiooni efektiivsust mõjutab DNA preparaadi puhtusaste, s.t. teatud inhibiitorite olemasolu reaktsioonisegus, millest mõnel juhul võib olla äärmiselt raske vabaneda. Mõnikord ei saa nende olemasolu tõttu võimendada isegi kümneid tuhandeid sihtmärk-DNA molekule. Seega puudub sageli otsene seos sihtmärk-DNA esialgse koguse ja amplifikatsiooniproduktide lõpliku koguse vahel.

3.3.1 Horisontaalse elektroforeesi meetod

Võimendustulemuste visualiseerimiseks kasutatakse erinevaid meetodeid. Tänapäeval on kõige levinum meetod elektroforees, mis põhineb DNA molekulide eraldamisel suuruse järgi. Selleks valmistage agaroosgeeli plaat, mis pärast sulamist elektroforeesipuhvris kontsentratsiooniga 1,5–2,5% tahkub, lisades selleks spetsiaalset DNA-värvi, näiteks etiidiumbromiidi. Tahkunud agaroos moodustab ruumilise võre. Kammide abil valamisel moodustuvad geelis spetsiaalsed süvendid, millesse seejärel lisatakse võimendusproduktid. Geeliplaat asetatakse horisontaalsesse geelelektroforeesiaparaati ja ühendatakse püsipingeallikas. Negatiivselt laetud DNA hakkab geelis liikuma miinusest plussi. Sel juhul liiguvad lühemad DNA molekulid kiiremini kui pikemad. DNA liikumise kiirust geelis mõjutavad agaroosi kontsentratsioon, elektrivälja tugevus, temperatuur, elektroforeesipuhvri koostis ja vähemal määral DNA GC koostis. Kõik ühesuurused molekulid liiguvad sama kiirusega. Värvaine liidetakse (interkaleeritakse) tasapinnaliste rühmade abil DNA molekulidesse. Pärast elektroforeesi lõppu, mis kestab 10 minutit kuni 1 tund, asetatakse geel transilluminaatori filtrile, mis kiirgab valgust ultraviolettkiirguse vahemikus (254–310 nm). DNA poolt 260 nm juures neeldunud ultraviolettkiirgus kantakse üle värvainele, põhjustades selle nähtava spektri oranžikaspunases piirkonnas (590 nm) fluorestseerumist.

Võimendustoote ribade heledus võib varieeruda. Seda ei saa aga seostada sihtmärk-DNA esialgse kogusega proovis.

3.3.2 Vertikaalse elektroforeesi meetod

Vertikaalse elektroforeesi meetod on põhimõtteliselt sarnane horisontaalse elektroforeesiga. Nende erinevus seisneb selles, et sel juhul kasutatakse agaroosi asemel polüakrüülamiidgeele. See viiakse läbi spetsiaalses vertikaalse elektroforeesi kambris. Polüakrüülamiidgeelelektroforeesil on agarooselektroforeesiga võrreldes suurem lahutusvõime ja see võimaldab ühe nukleotiidi täpsusega eristada erineva suurusega DNA molekule. Polüakrüülamiidgeeli valmistamine on mõnevõrra keerulisem kui agaroosgeeli valmistamine. Lisaks on akrüülamiid mürgine aine. Kuna vajadus määrata amplifikatsiooniprodukti suurus 1 nukleotiidi täpsusega tekib harva, kasutatakse rutiinses töös horisontaalse elektroforeesi meetodit.

3.4 Amplifikatsioonireaktsiooni edenemise jälgimine

3.4.1 Positiivsed juhtelemendid

Positiivse kontrollina kasutatakse soovitud mikroorganismi DNA preparaati. Mittespetsiifilised amplikonid erinevad suuruse poolest kontroll-DNA preparaadiga amplifikatsiooni tulemusena tekkinud amplikonitest. Mittespetsiifilised tooted võivad olla positiivse kontrolliga võrreldes suuremad või väiksemad. Halvimal juhul võivad need suurused kokku langeda ja loetakse elektroforeesil positiivseks.

Saadud amplifikatsioonisaaduse spetsiifilisuse kontrollimiseks võite kasutada hübridisatsioonisonde (amplifitseeritud järjestuses paiknevad DNA lõigud), mis on märgistatud ensüümimärgiste või radioaktiivsete isotoopidega ja interakteeruvad DNA-ga samade põhimõtete kohaselt nagu praimerid. See muudab analüüsi oluliselt keerulisemaks ja pikendab ning selle maksumus suureneb oluliselt.

3.4.2 Sisekontroll

Igas reaktsioonisegu katseklaasis on vaja jälgida amplifikatsiooni kulgu. Sel eesmärgil kasutatakse täiendavat, nn sisekontrolli. See on mis tahes DNA preparaat, mis ei sarnane soovitud mikroorganismi DNA-ga. Kui reaktsioonisegule lisatakse sisemine kontroll, muutub see praimeri anniilimise jaoks samaks sihtmärgiks kui soovitud nakkustekitaja kromosomaalne DNA. Sisekontrolli amplifikatsiooniprodukti suurus valitakse nii, et see oleks 2 või enam korda suurem kui soovitud mikroorganismi DNA amplifitseerimisel tekkinud amplikonid. Selle tulemusena, kui reaktsioonisegule lisatakse koos uuritava prooviga sisekontrolli DNA, siis olenemata mikroorganismi olemasolust bioloogilises proovis, põhjustab sisekontroll spetsiifiliste amplikonide moodustumist, kuid oluliselt pikema (raskema) amplikonide moodustumist. kui mikroorganismi amplikon. Raskete amplikonide olemasolu reaktsioonisegus näitab amplifikatsioonireaktsiooni normaalset kulgu ja inhibiitorite puudumist. Kui vajaliku suurusega amplikonid ei moodustu, aga ka sisekontrolli amplikonid ei moodustu, võime järeldada, et analüüsitavas proovis on ebasoovitavaid lisandeid, mis tuleks kõrvaldada, kuid mitte soovitud DNA puudumise kohta.

Kahjuks on selle lähenemisviisi kogu atraktiivsusest hoolimata sellel märkimisväärne viga. Kui reaktsioonisegus on soovitud DNA, siis selle amplifikatsiooni efektiivsus väheneb järsult praimerite sisekontrolliga konkurentsi tõttu. See on eriti oluline madala DNA kontsentratsiooni korral uuritavas proovis, mis võib põhjustada valenegatiivseid tulemusi.

Kuid eeldusel, et praimerite konkurentsiprobleem on lahendatud, on see võimenduse efektiivsuse jälgimise meetod kindlasti väga kasulik.

4. Polümeraasi ahelreaktsioonil põhinevad meetodid

4.1 Kvalitatiivne analüüs

Klassikaline PCR teostamise meetod, mille põhimõtted on ülalpool välja toodud, on välja töötatud mõnede modifikatsioonidena, mille eesmärk on ületada PCR piirangud ja suurendada reaktsiooni efektiivsust.

4.1.1 PCR-i teostamise meetod "kuumkäivitusega"

Mittespetsiifiliste amplifikatsioonireaktsiooni produktide moodustumise ohu vähendamiseks kasutatakse "kuumkäivituse" meetodit. Selle põhiolemus on vältida reaktsiooni algust, kuni katseklaasis on saavutatud tingimused, mis tagavad praimerite spetsiifilise lõõmutamise.

Fakt on see, et sõltuvalt GC koostisest ja suurusest on praimeritel teatud sulamistemperatuur (Tm). Kui süsteemi temperatuur ületab Tm, ei suuda praimer DNA ahelaga kinnituda ja denatureerub. Optimaalsetel tingimustel, s.o. Sulamistemperatuurile lähedase anniilimistemperatuuri korral moodustab praimer kaheahelalise molekuli ainult siis, kui see on täielikult komplementaarne ja tagab seega reaktsiooni spetsiifilisuse.

Kuumkäivituse rakendamiseks on erinevaid võimalusi:

Taq polümeraasi lisamine reaktsioonisegule esimese tsükli jooksul pärast toru kuumutamist denatureerimistemperatuurini.

Reaktsioonisegu koostisosade eraldamine parafiinikihiga kihtideks (alumises osas - praimerid, ülemises osas - Taq polümeraas ja DNA sihtmärgid), mis segatakse parafiini sulamisel (~ 65-75 0 C).

Taq polümeraasi vastaste monoklonaalsete antikehade kasutamine. Monoklonaalsete antikehadega seotud ensüüm muutub aktiivseks alles pärast esimest denaturatsioonifaasi, mil monoklonaalsed antikehad on pöördumatult denatureeritud ja vabastavad Taq polümeraasi aktiivsed saidid.

Kõigil ülaltoodud juhtudel, isegi kui mittespetsiifiline anniilimine toimus enne temperatuuritsükli algust, ei toimu pikenemist ja kuumutamisel praimer-DNA kompleksid denatureeritakse, nii et mittespetsiifilisi tooteid ei moodustu. Seejärel ei lange temperatuur katseklaasis alla sulamistemperatuuri, mis tagab spetsiifilise võimendusprodukti moodustumise.

4.1.2 RNA molekulide tuvastamine

Võimalus kasutada RNA-d PCR-i sihtmärgina laiendab oluliselt selle meetodi rakendusala. Näiteks paljude viiruste (C-hepatiit, gripiviirus, pikornaviirused jne) genoome esindab RNA. Veelgi enam, nende elutsüklis puudub DNA-ks muundumise vahefaas. RNA tuvastamiseks tuleb see esmalt muuta DNA vormiks. Selleks kasutatakse pöördtranskriptaasi, mis eraldatakse kahest erinevast viirusest: lindude müeloblastoosi viirus ja Moloney hiire leukeemia viirus. Nende ensüümide kasutamine tekitab mõningaid raskusi. Esiteks on need termolabiilsed ja seetõttu saab neid kasutada temperatuuril, mis ei ületa 42 °C. Kuna sellel temperatuuril moodustavad RNA molekulid kergesti sekundaarseid struktuure, väheneb reaktsiooni efektiivsus märgatavalt ja on erinevatel hinnangutel ligikaudu 5%. Sellest puudusest püütakse mööda hiilida, kasutades pöördtranskriptaasina termostabiilset polümeraasi, mis on saadud termofiilsest mikroorganismist Thermus Thermophilus, millel on Mn2+ juuresolekul transkriptaasi aktiivsus. See on ainus teadaolev ensüüm, mis on võimeline avaldama nii polümeraasi kui ka transkriptaasi aktiivsust.

Pöördtranskriptsioonireaktsiooni läbiviimiseks peab reaktsioonisegu, nagu ka PCR-is, sisaldama praimereid praimerina ja 4 dNTP segu ehitusmaterjalina.

Pärast pöördtranskriptsioonireaktsiooni läbiviimist võivad saadud cDNA molekulid olla PCR-i sihtmärgiks

5. PCR teostamise tehnoloogilise protsessi korraldus

Polümeraasi ahelreaktsiooni potentsiaalselt kõrge tundlikkus muudab PCR labori eriti hoolika kavandamise hädavajalikuks. See on tingitud kõigest terav probleem meetod - saastumine.

Saastumine on spetsiifiliste DNA molekulide sisenemine väliskeskkonnast reaktsioonisegusse, mis võivad toimida amplifikatsioonireaktsiooni sihtmärkidena ja anda valepositiivseid tulemusi.

Selle ebameeldiva nähtuse vastu võitlemiseks on mitu võimalust. Üks neist on ensüümi N-uratsiilglükosülaasi (UG) kasutamine. See meetod põhineb UG võimel lõhustada DNA molekule manustatud uratsiiliga. Amplifitseerimisreaktsioon viiakse läbi dNTP seguga, milles dTTP on asendatud uratsiiliga, ja pärast termilist tsüklit sisaldavad kõik katseklaasis moodustunud amplikonid uratsiili. Kui reaktsioonisegule lisatakse enne amplifikatsiooni CG-d, hävivad reaktsioonisegusse sisenevad amplikonid, samas kui natiivne DNA jääb puutumatuks ja on seejärel amplifikatsiooni sihtmärk.

Seega kõrvaldab see meetod ainult teatud määral saasteallika ega garanteeri valepositiivsete tulemuste eest.

Teine viis saastumise tulemuste vastu võitlemiseks on reaktsioonitsüklite arvu märkimisväärne vähendamine (kuni 25-30 tsüklit). Kuid isegi selle lähenemisviisi korral on valepositiivsete tulemuste saamise oht suur, kuna sel juhul on inhibiitorite puudumisel saastumise tõttu lihtne saada amplifikatsiooniprodukti.

Seega, vaatamata valepositiivseid tulemusi põhjustavate DNA molekulide inaktiveerimisele suunatud eelamplifikatsioonimeetmete eelistele, on kõige radikaalsem abinõu hästi läbimõeldud laboriorganisatsioon.

Järeldus

Kõige laialdane kasutamine PCR-meetodist on nüüdseks saanud erinevate nakkushaiguste diagnoosimise meetod. PCR võimaldab tuvastada infektsiooni etioloogiat ka siis, kui analüüsiks võetud proov sisaldab vaid üksikuid patogeeni DNA molekule. PCR-i kasutatakse laialdaselt HIV-nakkuste, viirushepatiidi jne varajasel diagnoosimisel. Tänapäeval pole peaaegu ühtegi nakkustekitajat, mida ei saaks PCR abil tuvastada.

Loe ka

Konsultatsioon proktoloogiga

Kuidas koerale õigesti süsti teha

2023-11-03 01:38:00 Kommentaarid veel puuduvad

Traditsiooniline hemorroidide ravi

Sharapovo, sorteerimiskeskus: kus see on, kirjeldus, funktsioonid

2023-11-03 01:38:00 Kommentaarid veel puuduvad

Hemorroidide ennetamine

Usaldusväärsus – mõõtmistehnika korduval rakendamisel saadud tulemuste järjepidevuse aste

2023-11-03 01:38:00 Kommentaarid veel puuduvad