PCR metoda lančane reakcije polimeraze omogućava vam da odredite. Lančana reakcija polimeraze

PRINCIP METODE (molekularna biološka osnova)

Među širokim spektrom hibridizacijskih metoda za analizu DNK, PCR metoda koji se najviše koristi u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici.

Princip metode lančana reakcija polimeraze (PCR)(Lančana reakcija polimeraze (PCR)) razvio je Kary Mullis (Cetus, SAD) 1983. godine. i trenutno se široko koristi kako za naučna istraživanja tako i za dijagnostiku u praktična zdravstvena zaštita i Državne službe za sanitarni i epidemiološki nadzor (genotipizacija, dijagnostika zarazne bolesti).

PCR metoda se temelji na prirodnom procesu - komplementarnom dovršavanju DNK matrice, koji se provodi pomoću enzima DNK polimeraze. Ova reakcija se zove DNK replikacija.

Prirodna replikacija DNK uključuje nekoliko faza:

1) Denaturacija DNK(odmotavanje dvostruke spirale, divergencija lanaca DNK);

2) Formiranje kratkih dvolančanih DNK sekcija(prajmeri neophodni za iniciranje sinteze DNK);

3) Sinteza novog lanca DNK(komplementarni završetak obje teme)

Ovaj proces se može koristiti za dobijanje kopija kratki dijelovi DNK specifični za specifične mikroorganizme, one. vršiti ciljanu potragu za takvim specifičnim područjima, što je cilj genske dijagnostike za identifikaciju uzročnika zaraznih bolesti.

Otkriće termostabilne DNK polimeraze (Taq polimeraze) iz termofilnih bakterija Thermis aquaticus, čiji je optimum u području od 70-72°C, omogućio je da se proces replikacije DNK učini cikličnim i koristi za rad in vitro. Stvaranjem programabilnih termostata (pojačavača), koji vrše ciklične promjene temperature prema zadatom programu, stvoreni su preduslovi za široko uvođenje PCR metode u praksu laboratorijske kliničke dijagnostike. Višestrukim ponavljanjem ciklusa sinteze dolazi do eksponencijalnog povećanja broja kopija određenog fragmenta DNK, što omogućava da se iz male količine analiziranog materijala, koji može sadržavati pojedinačne ćelije mikroorganizma, dobiti dovoljan broj kopija DNK. identificirati ih elektroforezom.

Komplementarni završetak lanca ne počinje ni u jednoj tački u sekvenci DNK, već samo u određenim početnim blokovima - kratkim dvolančanim dijelovima. Pričvršćivanjem takvih blokova na određene dijelove DNK, moguće je usmjeriti proces sinteze novog lanca samo u ovoj dionici, a ne duž cijele dužine lanca DNK. Za stvaranje početnih blokova u datim dijelovima DNK, dva oligonukleotidna prajmera (20 nukleotidnih parova), tzv. prajmeri. Prajmeri su komplementarni DNK sekvencama na lijevoj strani i desne granice specifični fragment i orijentisani su na takav način da se završetak novog lanca DNK događa samo između njih.

Dakle, PCR je višestruko povećanje broja kopija (amplifikacija) specifične regije DNK katalizirano enzimom DNK polimerazom.

Potrebno je izvršiti pojačanje sledeće komponente:

Mješavina deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih DNK lanaca)

Enzim Taq polimeraza(termostabilna DNK polimeraza koja katalizuje produžavanje lanaca prajmera uzastopnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizovane DNK).

Puferski rastvor(reakcioni medij koji sadrži Mg2+ jone neophodne za održavanje aktivnosti enzima)
Za identifikaciju specifičnih regiona genoma RNK virusa, prvo se dobije kopija DNK iz RNA šablona pomoću reakcije reverzne transkripcije (RT) koju katalizira enzim revertaza (reverzna transkriptaza).

Da bi se dobio dovoljan broj kopija željenog karakterističnog DNK fragmenta, amplifikacija uključuje nekoliko (20-40) ciklusa.

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 faze koje se javljaju u različitim temperaturnim uslovima Faza 1: Denaturacija DNK(rasplet dvostruke spirale). Javlja se na 93-95°C u trajanju od 30-40 sekundi. Faza 2: Pričvršćivanje prajmera (žarenje). Spajanje prajmera se dešava komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNK na granicama specifičnog regiona. Svaki par prajmera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja -20-60 sec. Faza 3: Završetak DNK lanaca. Komplementarno dodavanje lanaca DNK događa se od 5'-kraja do 3'-kraja lanca u suprotnim smjerovima, počevši od mjesta vezivanja prajmera. Materijal za sintezu novih DNK lanaca su deoksiribonukleotid trifosfati (dNTP) dodani u otopinu. Proces sinteze katalizira enzim termostabilna DNK polimeraza (Taq polimeraza) i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze je 20-40 sekundi.

Novi DNK lanci formirani u prvom ciklusu amplifikacije služe kao šabloni za drugi ciklus amplifikacije, u kojem se formira željeni specifični DNK fragment (amplikon). (vidi sliku 2). U narednim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao šablon za sintezu novih lanaca. Dakle, amplikoni se akumuliraju u otopini prema formuli 2n, gdje je n broj ciklusa amplifikacije. Stoga, čak i ako je početna otopina u početku sadržavala samo jednu dvolančanu DNK molekulu, tada se u 30-40 ciklusa u otopini akumulira oko 108 molekula amplikona. Ova količina je dovoljna za pouzdanu vizuelnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu. Proces pojačanja se odvija u posebnom programabilnom termostatu (pojačavaču), koji prema zadatom programu automatski mijenja temperature prema broju ciklusa pojačanja.

FAZE PCR ANALIZE

PCR metoda, kao alat za laboratorijsku dijagnostiku zaraznih bolesti, temelji se na detekciji malog DNK fragmenta patogena (nekoliko stotina parova baza), specifičnog samo za određeni mikroorganizam, korištenjem lančane reakcije polimeraze za akumulaciju željenog fragment.
Postupak analize PCR metodom uključuje tri faze:

1. Izolacija DNK (RNA) iz kliničkog uzorka

2. Amplifikacija specifičnih fragmenata DNK
3. Detekcija produkata amplifikacije

Izolacija DNK (RNA).
U ovoj fazi analize klinički uzorak se podvrgava posebnoj obradi, kao rezultat toga dolazi do lize ćelijskog materijala, uklanjanja frakcija proteina i polisaharida i dobijanja rastvora DNK ili RNK bez
inhibitori i spremni za dalje pojačanje.
Izbor tehnike izolacije DNK (RNA) uglavnom je određen prirodom kliničkog materijala koji se obrađuje.

Amplifikacija specifičnih fragmenata DNK
U ovoj fazi, kratki specifični DNK fragmenti se akumuliraju u količini potrebnoj za njihovo dalje otkrivanje. Većina metoda za određivanje specifičnih fragmenata genoma koristi tzv. “Klasična verzija ciljanog PCR-a. Da bi se povećala specifičnost i osjetljivost analize, neke metode koriste „ugniježđenu“ PCR metodu, koja koristi 2 para prajmera („spoljni“ - za stadijum 1, i „unutrašnji“ - za stadijum 2).

Detekcija produkata pojačanja
U većini metoda, u ovoj fazi, mješavina produkata amplifikacije dobivena u 2. fazi se odvaja horizontalnom elektroforezom u agaroznom gelu. Prije elektroforetskog odvajanja, u mješavinu za amplifikaciju dodaje se otopina etidijum bromida, koja formira jaka intersticijska jedinjenja sa dvolančanim DNK fragmentima. Ova jedinjenja su sposobna da fluoresciraju pod UV zračenjem, što se beleži u obliku narandžasto-crvenih svetlećih traka nakon elektroforetskog odvajanja mešavine amplifikacije u agaroznom gelu.

Kao alternativa metodi elektroforetske detekcije, koja ima neke nedostatke: subjektivnost u očitavanju rezultata, ograničenja u određivanju DNK različitih mikroorganizama u jednoj reakciji, može se predložiti šeme detekcije hibridizacije. U ovim shemama, fragment DNK formiran kao rezultat amplifikacije hibridizira (formira dvolančane komplekse - "hibride") sa specifičnom oligonukleotidnom sondom. Registracija takvih kompleksa može se izvršiti kolorimetrijski ili fluorimetrijski. SPF "Litekh" je kreirao komplete za detekciju zasnovane na hibridizaciji sa fluorimetrijskom registracijom rezultata

PREDNOSTI PCR METODE kao metode za dijagnostiku zaraznih bolesti:

- Direktno određivanje prisustva patogena

Mnogi tradicionalne metode dijagnostika, na primjer, enzimski imunosorbentni test, identifikuje proteine ​​markera koji su otpadni produkti infektivnih agenasa, što daje samo indirektan dokaz o prisutnosti infekcije. Identifikacija specifičnog dijela DNK patogena PCR-om daje direktnu indikaciju prisutnosti infektivnog agensa.

- Visoka specifičnost
Visoka specifičnost PCR metode je zbog činjenice da se u materijalu koji se proučava otkriva jedinstveni fragment DNK, karakterističan samo za dati patogen. Specifičnost je određena nukleotidnom sekvencom prajmera, koji eliminiše
mogućnost dobijanja lažnih rezultata, za razliku od metode enzimski imunotest, gdje su greške zbog unakrsne reakcije antigena česte.

- Visoka osetljivost
PCR metoda vam omogućava da otkrijete čak i pojedinačne ćelije bakterija ili virusa. PCR dijagnostika otkriva prisustvo uzročnika zaraznih bolesti u slučajevima kada se koriste druge metode (imunološke, bakteriološke,
mikroskopski) ovo se ne može učiniti. Osetljivost PCR analize je 10-1000 ćelija po uzorku (osetljivost imunoloških i mikroskopskih testova je 103-105 ćelija).

-Univerzitetski postupak za identifikaciju različitih patogena
Materijal za istraživanje PCR metodom je DNK patogena. Metoda se zasniva na identifikaciji fragmenta DNK ili RNK koji je specifičan za određeni organizam. Sličnosti hemijski sastav svih nukleinskih kiselina omogućava korištenje objedinjenih metoda za provođenje laboratorijskih istraživanja. Ovo omogućava dijagnosticiranje nekoliko patogena iz jednog biouzorka. Kao materijal za ispitivanje mogu se koristiti različiti biološki sekreti (sluz, urin, sputum), struganje epitelnih ćelija, krv i serum.

- Velika brzina primljen rezultat analize
Za provođenje PCR analize nije potrebno izolirati i uzgajati kulturu patogena koji uzima veliki broj vrijeme. Jedinstvena metoda za obradu biomaterijala i detekciju produkta reakcije, kao i automatizacija procesa amplifikacije omogućavaju izvođenje potpuna analiza za 4-4,5 sata.

Treba napomenuti da PCR metoda može otkriti patogene ne samo u kliničkom materijalu dobivenom od pacijenta, već iu materijalu dobivenom iz predmeta spoljašnje okruženje(voda, zemlja, itd.)

PRIMENA PCR METODE U PRAKTIČNOJ ZDRAVSTVENOJ ZAŠTITI

Korištenje PCR metode za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, kako bakterijskih tako i virusne prirode je od ogromnog značaja za rješavanje mnogih problema mikrobiologije i epidemiologije. Razvoju doprinosi i upotreba ove metode osnovna istraživanja u oblasti proučavanja hroničnih i slabo poznatih zaraznih bolesti.

Najefikasnija i ekonomski izvodljiva upotreba metode je u:

uroginekološka praksa- za otkrivanje klamidije, ureaplazmoze, gonoreje, herpesa, gardnereloze, mikoplazma infekcije;

u pulmologiji- za diferencijalnu dijagnozu virusne i bakterijske pneumonije, tuberkuloze;

u gastroenterologiji- za identifikaciju helikobakterioze;

u klinici za infektivne bolesti- kao ekspresna metoda za dijagnosticiranje salmoneloze, difterije, virusne hepatitis B, C i G;

u hematologiji- za otkrivanje citomegalovirusne infekcije, onkovirusa.

Sadržaj

Oni koji su zainteresovani za nove dijagnostičke metode treba da saznaju šta je to PCR metoda. Savremene tehničke mogućnosti u oblasti laboratorijskih istraživanja omogućavaju identifikaciju mnogih bolesti kod početnim fazama. Polimerazna lančana reakcija (PCR) se smatra ovog trenutka najpreciznija i nova metoda.

PCR analiza

PCR analiza - šta je to? Ova metoda koristi principe molekularne biologije. Za proučavanje materijala koriste se posebni enzimi koji više puta i brzo kopiraju fragmente DNK i RNK patogena. Postoji različite vrste PCR analiza u zavisnosti od materijala koji se testira (krv, urin, izmet, itd.). Nakon obrade, laboratorijsko osoblje uspoređuje dobiveni rezultat sa bazom podataka, identifikuje koncentraciju i vrstu patogena.

PCR analiza se stavlja u poseban ciklus (uređaj), koji zagrijava i hladi epruvete sa biomaterijalom. Promjene temperature su neophodne za replikaciju fragmenta. Točnost rezultata ovisit će o tačnosti temperaturnog režima. Metoda lančane reakcije polimerazom pomaže u identifikaciji:

• Infektivna mononukleoza;
• cytomegalo virusna infekcija;
• virusni hepatitis G, C, B, A;
• spolno prenosive infekcije/bolesti (SPI/SPB): gardnereloza, trihomonijaza, ureaplazmoza;
• herpes infekcija;
• onkogeni virusi;
• listerioza;
• infekcija Helicobacter pylori;
• krpeljni encefalitis, borelioza;
• tuberkuloza;
• kandidijaza.

Krv

U ovom trenutku, zbog novosti tehnologije, PCR testiranje krvi i dalje ima visoku cijenu. Za pripremu biomaterijala ne morate ispunjavati određene zahtjeve. Čak i uzrokovano fizička aktivnost, stres, promjene u ishrani, promjene u sastavu ne utiču na rezultate studije. PCR test krvi može se pokvariti samo uzimanjem antibakterijskih sredstava, tako da prije uzimanja testa morate napraviti pauzu između tretmana i testa.

PCR testiranje krvi je najčešća opcija za dijagnosticiranje kronične, akutne infektivne patologije sa virusnom ili atipičnom manifestacijom. Serološke metode Istraživanja imaju određene poteškoće u provođenju - prisustvo patogena određuje se prisustvom antitijela u ljudskom tijelu. Rezultat bi mogao biti lažno negativan ako stanje pacijenta nije omogućilo vrijeme za njihov razvoj.

razmazati

U oblasti ginekologije, PCR analiza razmaza se koristi za proučavanje prisustva infektivnih mikroorganizama. Rad s materijalom provodi se po istom principu kao i s krvlju: višestruko povećanje fragmenata DNK patogena kako bi se lako identificirao. Ovo također pomaže u otkrivanju skrivene infekcije u ženi. Za analizu se mogu uzeti različite biološke tekućine: pljuvačka, sputum, urin, krv. U ginekologiji se za precizno određivanje često koristi bris vaginalne sluznice iz cervikalnog kanala.

Postoje određene indikacije za izvođenje PCR-a. Često je to potrebno učiniti kako bi se identificirao patogen otporan na antibiotike. Kod žena, glavne indikacije za dijagnozu ovom metodom su:

• trudnoća koja je teška;
• akutna faza SPI;
• ako postoji sumnja da je SPI prešla u hroničnu fazu;
• traženje uzroka neplodnosti.

Kala

Za otkrivanje infekcije, liječnik može propisati PCR test stolice. Da biste dobili najpouzdanije rezultate nakon testa, morate se pridržavati sljedećih pravila prije prikupljanja biomaterijala:

• prestati uzimati laksative nekoliko dana prije: ulja, supozitorije;
• isključite lijekove koji daju određenu boju stolici, na primjer, koji sadrže željezo.

Urin

Ako je potrebno, Vaš ljekar može uzeti urin za testiranje. Visoka preciznost otvara mogućnost rada sa bilo kojom biološkom tekućinom iz koje se može izdvojiti virusna DNK. Da biste napravili PCR test urina, morate se pridržavati sljedećih ograničenja prije prikupljanja materijala:

• prekinuti seksualni odnos najmanje 1 dan prije zahvata;
• 3 sedmice prije testa potrebno je završiti bilo kakav antibakterijski tretman, jer će lijekovi zamagliti sliku;
• Test morate uraditi na prazan želudac (tečnosti su takođe zabranjene);
• Morate uzeti prvu jutarnju porciju materijala.

Rezultati PCR testa

Iz navedenog je jasno šta je PCR analiza i vidljive su jasne prednosti ove metode istraživanja. Još jedna prednost ove dijagnostičke procedure je jednostavnost dešifriranja rezultata. S obzirom na to koliko traje PCR analiza (sam proces traje oko 5 sati, a laboratorija proizvodi podatke za 1-2 dana), ovu metodu dijagnostika postaje najbolja opcija za identifikaciju mnogih infekcija. Na osnovu rezultata, Vaš lekar Vam može reći da test:

1. Negativno – testni materijal nije sadržavao željeni patogen.
2. Pozitivno - pronađeni su RNK i DNK patogena.

Ponekad se provodi kvantitativno određivanje mikroorganizama. Ovo je neophodno za bolesti koje su uzrokovane oportunističkim patogenima. Posebnost ovih virusa je u tome što se pojavljuju samo u prevelikim količinama i izuzetno je problematično pronaći ih konvencionalnim istraživanjima. Ovaj faktor je važan za odabir terapijskih taktika za efikasno liječenje virusnih infekcija, na primjer, hepatitisa, HIV-a.

Za 12 infekcija

Da u potpunosti razumem šta je to PCR dijagnostika infekcije i koliko je efikasan, morate znati da može izolovati do 12 patogena. Tekst se izvodi samo u laboratorijskim uslovima. Za istraživanje se koriste posebni enzimi koji višestruko povećavaju količinu RNA i DNK fragmenata virusa. PCR analiza za 12 infekcija može otkriti:

• Mycobacterium tuberculosis;
• citomegalovirus;
• hepatitis C, G, B, A;
• herpes 1, 2 vrste;
• Epstein-Barr virus (infektivna mononukleoza);
• infekcije koje se prenose spolnim putem, na primjer, klamidija;
• listerioza;
• infekcija kandidom;
• Helicobacter pylori;
• borelioza, krpeljni encefalitis.

Za hepatitis C

Ova dijagnostička metoda pomaže u određivanju prisutnosti virusa u krvi. To daje liječnicima priliku da govore o njegovom prisustvu ili odsustvu. Postoje dvije vrste PCR analize za hepatitis C: kvalitativna i kvantitativna. Prva opcija ukazuje samo na njegovo prisustvo i može imati formulaciju "otkriveno"/"nije otkriveno". Ova vrsta testa ima osjetljivost od 10-500 IU/ml. To znači da ako je sadržaj patogena u tijelu nizak, analiza neće biti "otkrivena".

Kvantitativna analiza je preciznija i pokazaće koncentraciju infekcije u krvi. Ovaj indikator se naziva "virusno opterećenje" i mjeri se u količini virusne RNK po specifičnoj zapremini krvi. Dekodiranje u različitim laboratorijama može se razlikovati. Pored mjerenja IU/ml, koriste se i jedinice za “kopiranje”. Možete računati kopije po IU koristeći formulu: 1 IU = 4 kopije. Ako vrijednost dekodiranja za prisustvo virusa prelazi 800.000 IU/ml (ili 800*103), to ukazuje na visok sadržaj patogena.

Za tuberkulozu

Test treba uraditi ujutru. Ovo je važno kako bi se spriječilo da cjelokupna masa sputuma koja se stvorila preko noći ne napusti želudac. PCR analiza za tuberkulozu je jednako važna kao ELISA, Mantoux i tomografija. Test pomaže da se utvrdi prisustvo mikobakterija, stanje mokraće, ukupnog imunoglobulina, ESR i utvrdi trenutno stanje pluća. Da bi se osigurali tačni rezultati, PCR analiza se mora provesti u skladu sa sljedećim pravilima:

1. Sjetva se vrši 3 puta, ali potpunu aspiraciju želudačnog sadržaja treba izvršiti samo u bolničkim uvjetima.
2. Mikobakterije se otkrivaju kulturom postojećih masa u želucu u manje od 50% dijagnoza. Čak i kada se postignu optimalni uslovi, preporučuje se ultrazvuk.
3. Čak i ako je rezultat negativan, ne može se potpuno isključiti mogućnost razvoja tuberkuloze s promjenama ESR, imunoglobulina ili drugih pokazatelja.
4. Inokulacija materijala tokom PCR-a je manje podložna patološka stanja, ako je dobijena u sklopu bronhoskopskog pregleda, čime se isključuje sumnja na tuberkulozu kod djeteta.

Za HIV

Za mnoge ljude ovu dijagnozu smatrao smrtnom kaznom. Iz tog razloga, nakon čestih spolnih odnosa, osoba postaje pažljivija na signale koje tijelo daje (a ponekad ih i izmišlja). Najpouzdanija opcija za dobijanje potvrde ili opovrgavanja ove bolesti je PCR test na HIV. Test se može koristiti za utvrđivanje sljedećeg mogući problemi sa zdravljem:

1. Pobijanje/potvrda prisustva HIV-a tokom seronegativnog perioda.
2. Određivanje genotipa HIV-1, HIV-2.
3. Pojašnjenje opisa patološki proces ako je rezultat imunoblota upitan.
4. Infekcija nakon transfuzije krvi.
5. Određivanje HIV statusa kod djece rođene od majki koje su nosioci bolesti.
6. Pomaže u uspostavljanju praćenja virusnog opterećenja organizma.

Za HPV

Papiloma virus se može otkriti kod bilo koje osobe, dugo vremena može biti u latentnom stanju. Razvoj je izazvan oslabljenim imunitetom, stresom ili emocionalnim izljevima. PCR test za HPV pomaže u određivanju koncentracije virusa u krvi. Iz tog razloga, preporučuje se da se određivanja vrše kvantitativno, a ne kvalitativno. Ovi podaci će pomoći da se predvidi vjerovatnoća maligne infekcije.

Metoda za dijagnosticiranje prisustva HPV-a zasniva se na glavnom svojstvu PCR-a da izoluje virusnu DNK iz materijala. Zbog visoke osjetljivosti testa, otkrit će se čak i male količine bakterija. Kvantitativno istraživanje pruža ljekarima mogućnost da utvrde stepen opasnosti od bolesti i naprave prognozu za budućnost. Ova dijagnoza je obavezna za sve muškarce i žene kod kojih su otkriveni kondilomi. Kvantitativna PCR analiza pomoći će da se utvrdi što je uzrokovalo razvoj HPV-a: privremeno smanjenje imuniteta ili kronična bolest.

Za herpes

Ova vrsta mikrobiološke dijagnostike pomaže u izvođenju PCR analize na herpes sa visokom preciznošću. Kopiranje fragmenata virusne DNK će se dogoditi samo ako je željeni gen prisutan u materijalu. U ovom slučaju, rezultati testa mogu ukazivati ​​na prisustvo ili odsustvo patogena. Može se otkriti čak i pri niskim koncentracijama u krvi.

Još jedna prednost PCR analize je da se može otkriti herpes virusna infekcija odmah nakon infekcije, prije pojave kliničkih simptoma. Možete odrediti vrstu herpesa (1 ili 2 nije potrebna posebna priprema za uzimanje testa, ali liječnici preporučuju da prije uzimanja krvi odbijete:);

• pržena;
• akutna;
• alkohol;
• debeo.

Tokom trudnoće

Prilikom nošenja djeteta veoma je važno provesti ovo istraživanje kako bi se registrovalo stanje žene. PCR analiza u trudnoći je uvrštena u listu najomiljenijih efikasne metode utvrđivanje prisustva raznih bolesti. Test je neophodan ne samo za identifikaciju patologija, već i za određivanje vjerojatnosti infekcije djeteta u maternici. Samo zahvaljujući PCR dijagnostici postalo je moguće identificirati stupanj progresije, razvoj mnogih infekcija unutar maternice.

Uzimanje PCR testova

Ako se pitate kako se uzima PCR analiza, onda treba razmotriti svaki pojedinačni slučaj, uzimajući u obzir vrstu biomaterijala. Struganje, bris ili vađenje krvi imaju svoje karakteristike, na primjer:

• plazma se donira ujutro;
• urin se uzima samo prvo ujutro, u laboratorijskim uslovima u sterilnoj posudi;
• bris ili struganje će biti indikativni samo nakon suzdržavanja od seksualnog odnosa najmanje 3 dana;
• Ne možete uzeti bris tokom menstruacije i 2 dana nakon nje.

Gdje se testirati za PCR

Ova vrsta istraživanja odnosi se na moderne i visokotehnološke dijagnostičke metode. Testove primjenom PCR metode treba obaviti u laboratorijama koje imaju svu potrebnu opremu za dobivanje potpunih rezultata. Kvalificirano i obučeno osoblje igra jednako važnu ulogu. Dajte prednost velikim, ozbiljnim, dobro poznatim laboratorijama. Ovo ne samo da će vam pomoći da brzo dobijete rezultate, već će i osigurati njihovu pouzdanost.

Cijena

Još jedno pitanje koje često zanima pacijente: koliko košta PCR test? Zbog novine metode i potrebe za nabavkom skupe opreme, cijena testa je relativno visoka. Cijena PCR-a ovisi o vrsti infekcije na koju će se osoba testirati. Okvirna cijena i vrijeme testiranja su kako slijedi:

1. SPI će se provjeriti za 1 dan, cijena je 400-500 rubalja.
2. Herpes, HPV, Epstein-Barr virus, citomeglovirus se otkrivaju u roku od 24 sata, cijena - 300-500 rubalja.
3. Analiza hepatitisa se provodi u roku od 5 dana, cijena za kvalitativnu opciju je 500 rubalja, kvantitativna opcija je 2000 rubalja.
4. Helicobacter pylori se otkriva u roku od 24 sata, cijena je 400 rubalja.
5. Antigeni, antitijela na HIV, cijena - od 380 rubalja.
6. Kvalitativna analiza HIV RNK, cijena - od 3.500 rubalja.
7. Kvantitativna analiza HIV RNK, cijena – od 11.000 rub.

Video

Pažnja! Informacije predstavljene u članku su samo u informativne svrhe. Materijali u članku ne potiču na samoliječenje. Samo kvalificirani liječnik može postaviti dijagnozu i dati preporuke za liječenje na osnovu individualnih karakteristika određenog pacijenta.

Pronašli ste grešku u tekstu? Odaberite ga, pritisnite Ctrl + Enter i sve ćemo popraviti!

Lančana reakcija polimerazom (PCR, PCR - lančana reakcija polimeraze) je metoda dobivanja više kopija određenih fragmenata DNK (gena) u biološkom uzorku.

Suština PCR-a kao metode molekularne biologije je ponovljeno selektivno kopiranje specifičnog gena (dijela DNK) korištenjem posebnih enzima pod uvjetima in vitro. Važna karakteristika PCR-a je proizvodnja kopija specifičnog dijela DNK (gena) koji ispunjava određene uslove. Sinonim za proces kopiranja DNK je "amplifikacija". DNK replikacija in vivo takođe se može smatrati pojačanjem. Međutim, za razliku od replikacije, proces lančane reakcije polimerazom umnožava kratke dijelove DNK (maksimalno 40.000 parova baza).

Osnovni principi

Dakle, PCR je ponovljeno kopiranje određenih fragmenata DNK in vitro tokom ponovljenih temperaturnih ciklusa. Kako se proces reakcije odvija unutar jednog temperaturnog ciklusa?

Formiranje nukleotidnog lanca vrši enzim DNK polimeraza. Međutim, da bi započeo rad, enzimu je potrebna lansirna platforma. Platforme su "prajmeri" (seederi) - sintetički oligonukleotidi dužine 15-20 nukleotida. Moraju postojati dva prajmera (prednji i reverzni), oni su komplementarni dijelovima DNK šablona, ​​a DNK polimeraza će više puta kopirati DNK fragment ograničen prajmerima. Rad polimeraze je da uzastopno dodaje nukleotide komplementarne sekvenci DNK šablona. Tako se u jednom temperaturnom ciklusu ponovo sintetiziraju dva nova fragmenta DNK (pošto je molekul DNK dvolančan, u početku postoje dvije matrice). Dakle, tokom 25-35 ciklusa, milijarde kopija DNK regije određene prajmerima akumuliraju se u epruveti. Struktura zasebnog ciklusa može se predstaviti na sljedeći način:

1. Denaturacija DNK (topljenje, divergencija lanaca DNK) - 95°C - 1 ili 2 minute;
2. žarenje prajmera (prajmeri se vezuju za DNK šablon, temperatura ove faze je određena nukleotidnim sastavom prajmera) - 60°C (na primer) - 1 minut;
3. Elongacija DNK (polimeraza sintetiše DNK lanac) - 72°C - 1 minut (vreme zavisi od dužine sintetizovanog fragmenta).

Instrumentacija za korištenje metode lančane reakcije polimeraze u laboratoriji treba da se sastoji od:

1. (ili, kako se još naziva, termalni ciklus);
2. sistemi za s (za vizualizaciju PCR rezultata);
3. sistemi (za analizu PCR rezultata);
4. (za pripremu uzorka);
5. set (mehanički ili elektronski).

Pored glavne i pomoćne opreme za puno funkcionisanje PCR laboratorije, neke Potrošni materijal: sterilni vrhovi, epruvete, stalci za epruvete i pipete.

Baza reagensa u konvencionalnoj PCR laboratoriji za izvođenje potpune lančane reakcije polimeraze uključuje enzim DNK polimerazu s puferom, prajmere (male sintetičke DNK fragmente komplementarne početku i kraju analiziranog dijela DNK šablona), mješavina nukleotida (A, T, G, C). Prečišćena voda je takođe apsolutno neophodna.

Prednosti PCR metode

Visoka osjetljivost studije

Osetljivost metode je takva da je moguće amplifikovati PCR-om i identifikovati ciljnu sekvencu čak i ako se pojavi jednom u uzorku od 10 5 ćelija.

Specifičnost testa

PCR vam omogućava da otkrijete DNK specifičnog infektivnog agensa u prisustvu DNK drugih mikroorganizama i DNK organizma domaćina, kao i da izvršite genotipizaciju. Specifičnim odabirom reakcionih komponenti (prajmera), možete istovremeno otkriti DNK blisko srodnih mikroorganizama.

Svestranost PCR metode

Činjenica je da za PCR dijagnostiku zaraznih bolesti ili nasljednih bolesti ljudi možete koristiti istu opremu, slijediti univerzalne procedure za pripremu i analizu uzoraka, kao i istu vrstu kompleta reagensa.

Uštedjeti vrijeme

Važna prednost PCR-a je nepostojanje faza kulturnog mikrobiološkog rada. Priprema uzoraka, izvođenje reakcija i analiza rezultata je što je moguće lakša i uglavnom automatizirana. Zahvaljujući tome, vrijeme za postizanje rezultata može se smanjiti na 4-5 sati.

Efikasnost PCR metode

Širina proučavanog kliničkog materijala

Kao uzorak u lančanoj reakciji polimeraze može se koristiti ne samo biološki materijal pacijenta, već i mnogi drugi supstrati u kojima se molekule DNK mogu identificirati s visokom osjetljivošću, na primjer, voda, tlo, hrana, mikroorganizmi, brisevi i još mnogo toga. .

Sve gore navedene prednosti ovoga jedinstvena metoda - visoka osjetljivost i specifičnost, identifikacija infektivnog agensa i genotipizacija bilo kojeg ljudskog gena, visoka efikasnost i ušteda vremena, svestranost baze instrumenata - omogućavaju da se PCR metoda danas široko koristi u kliničkoj dijagnostici, medicinskoj praksi, naučnim istraživanjima, kontroli kvaliteta i mnogim drugim drugim oblastima.

Primjena PCR

Područja primjene lančane reakcije polimeraze kao moderne metode molekularne biologije su raznolika. To je najvećim dijelom posljedica širine materijala koji se može analizirati (gotovo sve iz čega se može izolirati više ili manje kvalitetna DNK može postati predmet istraživanja), kao i odabrani prajmeri. Glavna područja primjene PCR-a:

klinička medicina

• dijagnostika zaraznih bolesti
• dijagnoza nasljednih bolesti
• detekcija mutacija
• genotipizacija
• ćelijske tehnologije
• stvaranje genetskih pasoša

ekologija

• praćenje stanja okruženje
• analiza hrane
• analiza genetski modifikovanih organizama (GMO)

sudske medicine i kriminologije

• ličnu identifikaciju
• utvrđivanje očinstva

farmakologija

veterinarska medicina

naučna istraživanja (molekularna biologija, genetika)

Organizacija PCR laboratorija

Informacije o naručivanju

Ime	Volume	Proizvodnja	Metoda	Kat.br.

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy"

nazvan po saveznoj agenciji za zdravstvo i socijalni razvoj Yasenetsky »

Odjel medicinska genetika i klinička neurofiziologija IPO

OSNOVNI PRINCIPI METODE

POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA

Metodički priručnik za studente 3-4 godine

na specijalnostima opšte medicine (060101) i

Krasnojarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovni principi metode polimerazne lančane reakcije. Metodički priručnik za vannastavni rad studenata 3-4 godine na specijalnostima opšte medicine (060101) i pedijatrije (060103). – Krasnojarsk: Izdavačka kuća Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja KrasSMA, 2007. – 42 str.

Metodološki priručnik je u potpunosti usklađen sa zahtjevima Državnog standarda (2000) i odražava glavne aspekte savremene metode dijagnosticiranja nasljednih ljudskih bolesti - metodu lančane reakcije polimeraze, edukativni materijal prilagođeno obrazovnim tehnologijama, uzimajući u obzir specifičnosti obuke na 3-4 godine medicinskih i pedijatrijskih fakulteta.

Recenzenti:Šef Katedre za medicinsku genetiku Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja

„Novosibirski državni medicinski univerzitet Federalne agencije za zdravstvo i društveni razvoj“, doktor medicinskih nauka, profesor;

DNK replikacija

Predmet proučavanja ove metode je deoksiribonukleinska kiselina (DNK). DNK je univerzalni nosilac genetskih informacija u svim organizmima koji postoje na Zemlji (s izuzetkom mikroorganizama koji sadrže RNK). DNK je dvostruki lanac uvijen u spiralu. Svaki lanac se sastoji od nukleotida povezanih u nizu. DNK lanci imaju suprotne smjerove: kraj od 5" jednog lanca odgovara kraju od 3" drugog lanca. Jedinstveno svojstvo DNK je njegova sposobnost udvostručavanja. Ovaj proces se zove replikacija. Replikacija molekula DNK događa se tokom sintetičkog perioda interfaze. Svaki od dva lanca "majčinog" molekula služi kao šablon za "ćerku". Nakon replikacije, novosintetizirana molekula DNK sadrži jedan „majčinski“ lanac, a drugi je novosintetizirani „ćerki“ lanac (polukonzervativna metoda). Za sintezu nove DNK molekule potrebno je da se stari molekul despirira i produži. Replikacija počinje na nekoliko mjesta u molekuli DNK. Zove se dio molekule DNK od početne točke jedne replikacije do početne točke druge replicon.

Početak replikacije je aktiviran prajmeri(prajmeri) koji se sastoje od 100-200 parova nukleotida. Enzim DNK helikaza se odmotava i dijeli matičnu spiralu DNK na dva lanca, na kojima se, po principu komplementarnosti, uz učešće enzima DNK polimeraze, sklapaju „ćerki“ DNK lanci. Da bi enzim započeo svoj rad, potrebno je prisustvo startnog bloka - malog početnog dvolančanog fragmenta. Početni blok se formira interakcijom prajmera sa komplementarnim regionom odgovarajućeg lanca roditeljske DNK. U svakom replikonu, DNK polimeraza se može kretati duž “majčinskog” lanca u samo jednom smjeru (5`=>3`).

Na vodećim pramenovima, kako se replikon odmotava, "kćerka" lanac postepeno kontinuirano raste. Na zaostalom lancu, lanac kćer se takođe sintetiše u pravcu (5`=>3`), ali u odvojenim fragmentima kako se replikon odmotava.

Dakle, dodavanje komplementarnih nukleotida lanaca "ćerke" događa se u suprotnim smjerovima (antiparalelno). Replikacija u svim replikonima se dešava istovremeno. Fragmenti i dijelovi "kćeri" lanaca sintetizirani u različitim replikonima su ušiveni u jedan lanac pomoću enzima ligaze. Replikaciju karakteriziraju polukonzervativnost, antiparalelnost i diskontinuitet. Cijeli genom ćelije se replicira jednom u vremenskom periodu koji odgovara jednom mitotičkom ciklusu. Kao rezultat procesa replikacije, iz jednog molekula DNK formiraju se dva molekula DNK, u kojima je jedan lanac iz matičnog molekula DNK, a drugi, kćer, novosintetizovan (slika 1).

Rice. 1. Shema replikacije molekula DNK.

Dakle, ciklus replikacije DNK uključuje tri glavne faze:

1. odmotavanje spirale DNK i divergencija lanaca (denaturacija);

2. pričvršćivanje prajmera;

3. dovršavanje lanca podređene niti.

Princip PCR metode

Replikacija DNK čini osnovu PCR-a. U PCR-u, gore navedeni procesi se izvode u epruveti u cikličnom režimu. Prijelaz iz jedne faze reakcije u drugu postiže se promjenom temperature inkubacione smjese. Kada se rastvor zagreje na 93-95°C, dolazi do denaturacije DNK. Da bi se prešlo na sljedeću fazu - dodavanje ili "žarenje" prajmera - smjesa za inkubaciju se ohladi na 50-65°C. Zatim se smjesa zagrije na 70-72°C - optimalno za taq-DNK polimerazu - u ovoj fazi dolazi do izgradnje novog lanca DNK. Zatim se ciklus ponovo ponavlja. Drugim riječima PCR metoda je višestruko povećanje broja kopija (pojačanje) specifičan dio DNK kataliziran enzimom DNK polimerazom.

Rast ćerki DNK lanaca mora se odvijati istovremeno na oba lanca DNK majke, tako da replikacija drugog lanca takođe zahteva sopstveni prajmer. Tako se u reakcionu smjesu dodaju dva prajmera: jedan za lanac “+”, drugi za lanac “-”. Nakon što se pričvrste za suprotne lance molekule DNK, prajmeri se ograničavaju na njen dio koji će se kasnije umnožavati ili umnožavati mnogo puta. Dužina takvog fragmenta, nazvanog amplikon, obično je nekoliko stotina nukleotida.

PCR faze

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 stupnja, koji se javljaju u različitim temperaturni uslovi(Sl. 2).

· 1. faza: Denaturacija DNK . Pojavljuje se na 93-95° u trajanju od 30-40 sekundi.

· 2. faza: prajmer žarenje . Vezivanje prajmera se dešava komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNK na granicama specifičnog regiona. Svaki par prajmera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja 20-60 sec.

· Faza 3: kompletiranje DNK lanaca se dešava od kraja 5" do kraja 3" lanca u suprotnim smerovima, počevši od mesta vezivanja prajmera. Materijal za sintezu novih DNK lanaca su dezoksiribonukleozid trifosfati dodani u otopinu. Proces sinteze katalizira enzim taq polimeraza i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze je 20-40 sekundi.

Novi DNK lanci formirani u prvom ciklusu amplifikacije služe kao šabloni za drugi ciklus amplifikacije, u kojem se formira specifični fragment DNK amplikona (slika 3). U narednim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao šablon za sintezu novih lanaca.

Dakle, akumulacija amplikona u rastvoru se dešava prema formuli 2", gde je n broj ciklusa amplifikacije. Dakle, čak i ako je početna otopina u početku sadržavala samo jedan dvolančani DNK molekul, onda u 30-40 ciklusa oko U rastvoru se akumulira 108 molekula amplikona. Ova količina je dovoljna za pouzdanu vizuelnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu.

Proces pojačanja se izvodi u posebnom programabilnom termostatu ( termalni ciklus), koji, prema zadatom programu, automatski mijenja temperature prema broju ciklusa pojačanja.

Za izvođenje pojačanja potrebne su sljedeće komponente:

· DNK matrica(DNK ili njen dio koji sadrži željeni specifični fragment);

· Prajmeri(sintetski oligonukleotidi (20-30 parova nukleotida), komplementarni DNK sekvencama na granicama specifičnog fragmenta koji se utvrđuje). Izbor specifičnog fragmenta i odabir prajmera igra ključnu ulogu u specifičnosti amplifikacije, što utiče na kvalitet analize.

· Mješavina deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih DNK lanaca u ekvivalentnim koncentracijama od 200-500 µM)

· EnzimTaq-polimeraza(termostabilna DNK polimeraza koja katalizuje produžavanje lanaca prajmera uzastopnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizovane DNK, 2-3 mM).

· Puferski rastvor(reakcioni medij koji sadrži Mg2+ jone neophodne za održavanje aktivnosti enzima, pH 6,8-7,8).

Za identifikaciju specifičnih regiona genoma RNK virusa, prvo se dobije kopija DNK iz RNA šablona pomoću reakcije reverzne transkripcije (RT) koju katalizira enzim revertaza (reverzna transkriptaza).

Rice. 2. Amplifikacija (1. ciklus).

Rice. 3. Amplifikacija (2. ciklus).

Glavne primjene PCR-a

· klinička medicina:

o dijagnoza infekcija,

o otkrivanje mutacija, uključujući dijagnozu nasljednih bolesti,

o genotipizacija, uključujući HLA genotipizaciju,

o ćelijske tehnologije

· ekologija (kao način praćenja stanja i kvaliteta ekoloških objekata i prehrambenih proizvoda)

· određivanje transgenih organizama (GMO)

Lična identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

· opšta i specifična biologija,

Osnovni principi

organizacija dijagnostičkih laboratorija

Rad u PCR laboratoriji obavlja se u skladu sa „Pravilima uređenja, sigurnosnih mjera, industrijske sanitacije, protivepidemijskog režima i lične higijene pri radu u laboratorijama (odjelima, odjeljenjima) sanitarno-epidemioloških ustanova zdravstvenog sistema.

Kontaminacija DNK uzoraka

Provođenje PCR dijagnostike je povezano s problemom zbog visoke osjetljivosti metode - mogućnost kontaminacije. Ulazak u reakcijsku epruvetu tragova pozitivne DNK (specifični produkti amplifikacije DNK - amplikoni; DNK standard koji se koristi kao pozitivna kontrola; pozitivna DNK iz kliničkog uzorka) dovodi do amplifikacije specifičnog DNK fragmenta tokom PCR-a i kao posljedicu , na izgled lažno pozitivni rezultati.

Tokom rada možete naići dvije vrste kontaminacije:

1. unakrsna kontaminacija od uzorka do uzorka (tokom obrade kliničkih uzoraka ili prilikom rastvaranja reakcione smjese), što dovodi do sporadičnih lažno pozitivnih rezultata;

2. kontaminacija produktima amplifikacije(amplikoni), što je od najvećeg značaja, jer se tokom PCR procesa amplikoni akumuliraju u ogromnim količinama i idealni su proizvodi za reamplifikaciju.

Kontaminacija staklenog posuđa, automatskih pipeta i laboratorijske opreme, površine laboratorijskih klupa, pa čak i površine kože laboratorijskih radnika sa količinama u tragovima amplikona dovodi do sistematskih lažno pozitivnih rezultata. Utvrđivanje izvora kontaminacije može biti vrlo teško i zahtijeva značajno ulaganje vremena i novca. Dosadašnje iskustvo stečeno u laboratorijama koje koriste PCR metodu za dijagnostiku omogućava nam da formulišemo osnovne zahtjeve za organizaciju takvih laboratorija i izvođenje samih analiza. Usklađenost sa ovim zahtjevima eliminira mogućnost kontaminacije i lažno pozitivnih rezultata.

Faze PCR analize

Geografski su razdvojeni tako što su smešteni u odvojene prostorije (sl. 4, 5):

· Pre-PCR soba, gde se obrađuju klinički uzorci, izoluje se DNK, priprema reakciona smeša za PCR i obavlja se PCR (ako postoje uslovi, preporučljivo je i poslednje dve faze da se sprovedu u dodatnoj zasebnoj prostoriji). U ovim prostorijama zabranjeno je obavljanje svih drugih vrsta radova sa test agensima, čija se PCR dijagnostika obavlja u ovoj laboratoriji.

· soba za post-PCR, gdje se vrši detekcija produkata amplifikacije. U ovoj prostoriji mogu se koristiti i druge metode detekcije. Preporučljivo je locirati prostoriju za detekciju proizvoda amplifikacije što je dalje moguće od prostorija za pre-PCR.

Radne prostorije su opremljene ultraljubičastim lampama sa maksimalnim zračenjem u području od 260 nm (tip DB-60) po stopi od 2,5 W po 1 m3. Lampe su postavljene tako da su površine radnih stolova, opreme i materijala sa kojima operater ima kontakt prilikom PCR analize izložene direktnom zračenju. Ozračenje se vrši u roku od 1 sata prije početka rada i 1 sat nakon završetka rada.

Laboranti rade u specijalnoj laboratorijskoj odjeći koja se mijenja pri prelasku iz jedne prostorije u drugu i u jednokratnim rukavicama. Odjeća iz različitih prostorija se obrađuje posebno. Različiti zaposlenici rade u različitim fazama PCR analize.

Za rad se koriste odvojeni setovi dozatora, plastično i stakleno posuđe, laboratorijska oprema, mantili i rukavice, namijenjeni za različite faze analize i nisu prenosivi iz jedne prostorije u drugu. Oprema, materijali i potrepštine u svakoj prostoriji su na odgovarajući način označeni.

Sve faze rada se izvode samo uz pomoć potrošnog materijala za jednokratnu upotrebu: vrhova za automatske pipete, epruvete, rukavice itd. Obavezno promijenite vrhove kada prelazite s uzorka na uzorak. Potrebno je koristiti vrhove s filterom - aerosolnom barijerom kako bi se spriječilo da mikrokapljice otopine uđu u pipetu. Korištene cijevi i vrhovi se odlažu u posebne posude ili posude koje sadrže otopinu za dezinfekciju. Klinički uzorci se čuvaju odvojeno od reagensa.

Za obradu i čišćenje radnog mjesta svaka prostorija je opremljena štapićima od pamučne gaze (maramice), pincetama, dezinfekcijskim i inaktivirajućim otopinama.

PCR dijagnostička laboratorija isključuje poslove vezane za proizvodnju (kloniranje) i izolaciju rekombinantnih plazmida koji sadrže sekvence DNK ili fragmente gena patogena koji se dijagnosticiraju u ovoj laboratoriji.

Prikupljanje kliničkog materijala

Materijal koji se proučava za PCR može biti struganje epitelnih ćelija, krvi, plazme, seruma, pleuralne i cerebrospinalne tečnosti, urina, sputuma, sluzi i drugih bioloških sekreta, biopsije.

Materijal se prikuplja u sali za tretmane odgovarajućeg profila. Nakon prikupljanja, uzorke treba što prije dostaviti u PCR dijagnostičku laboratoriju.

Uzorci se moraju uzimati sterilnim, po mogućnosti za jednokratnu upotrebu, instrumentima samo u sterilnim plastičnim epruvetama za jednokratnu upotrebu ili staklenim epruvetama, prethodno tretiranih sat vremena mešavinom hroma, dobro isprati destilovanom vodom i kalcinisati u sušionici na temperaturi od 150°C za 1 sat.

Zona detekcije (drugi sprat ili druga zgrada).

Rice. 4. PCR laboratorijski uređaj sa detekcijom elektroforezom.

Zona detekcije (drugi sprat ili druga zgrada)

Rice. 5. PCR laboratorijski uređaj sa fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza).

Rice. 6. Soba za ekstrakciju DNK. Prikazana je stolna kutija sa germicidnom lampom.

Rice. 7. Amplification room.

Rice. 8. Soba za detekciju.

Rice. 9. Uzorci krvi za DNK dijagnostiku nasljednih bolesti.

Čuvanje i transport uzoraka

Za dijagnosticiranje nasljednih bolesti, uzorci krvi se pohranjuju na posebnim papirnim formularima ili u epindorfima (plastične epruvete) u zamrznutom stanju dugo vremena (slika 9).

Za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, uzorci se drže na sobnoj temperaturi ne više od 2 sata. Ako je potrebno duže skladištenje, uzorci se mogu staviti u frižider na temperaturu od 2-8°C ne duže od jednog dana. Duže skladištenje (do 2 sedmice) je dozvoljeno zamrznuti u zamrzivaču na temperaturi od minus 20°C. Ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje uzoraka nije dozvoljeno.

Ako PCR dijagnostička laboratorija i soba za tretmane za uzorkovanje su geografski razdvojeni, onda se transport uzoraka vrši u termosama ili termo-kontejnerima u skladu sa pravilima za čuvanje uzoraka i pravilima za transport infektivnih materijala.

Ekstrakcija DNK iz uzoraka

Postala je široko rasprostranjena metoda sorpcije na čvrstoj fazi koja se sastoji od dodavanja sredstva za lizu koji sadrži otopinu gvanidina, sorpcije DNK na sorbentu, ponovljenog ispiranja i resorpcije DNK puferskom otopinom. Prilikom obrade seruma, plazme ili pune krvi obično se koristi metoda ekstrakcije fenola. Metoda uključuje deproteinizaciju fenolom/hloroformom nakon čega slijedi precipitacija DNK (ili RNK) etanolom ili izopropanolom. Obrada se vrši u Eppendor P epruvetama za mikrocentrifugu zapremine 1,5 ml. Vrijeme obrade je 1,5-2 sata (slika 10).

Rice. 10. Ekstrakcija DNK.

Izvođenje PCR-a

Određena količina uzorka iz obrađenog kliničkog uzorka prenosi se u specijalnu epruvetu za mikrocentrifugu tipa Eppendorf sa zapreminom od 0,2 ili 0,5 ml U koju se dodaje mešavina za amplifikaciju koja se sastoji od vode, PCR pufera, rastvora prajmera i rastvora ista epruveta (koja se dodaje poslednjoj) Uobičajeno, zapremina reakcione smeše je 25 μl se prenose na programabilni termostat (pojačalo), gde se pojačavanje vrši automatski prema zadatom programu (slika 11).

Rice. jedanaest. Pojačalo" Thermocycler ».

Vrijeme reakcije, ovisno o navedenom programu, je 2-3 sata. Paralelno sa eksperimentalnim uzorcima postavljaju se kontrolni uzorci: pozitivna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto materijala kliničkog uzorka dodaje kontrolni DNK preparat ispitivanog gena. Negativna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto kliničkog materijala ili DNK preparata dodaje odgovarajuća količina deionizirane vode ili ekstrakta koji ne sadrži DNK koja se testira. Negativna kontrola je neophodna da bi se provjerili komponente reakcije na odsustvo DNK zbog kontaminacije i da bi se isključili lažno pozitivni rezultati.

Registracija rezultata

Amplificirani specifični DNK fragment se detektuje elektroforezom u agaroznom gelu u prisustvu etidijum bromida. Etidijum bromid formira stabilno intersticijalno jedinjenje sa fragmentima DNK, koje se pojavljuje u obliku svetlećih traka kada se gel ozrači UV zračenjem talasne dužine 290-330 nm. U zavisnosti od veličine amplikona nastalih kao rezultat PCR-a, koristi se gel sa sadržajem agaroze od 1,5% do 2,5%. Za pripremu agaroznog gela, mješavina agaroze, pufera i vode se otopi u mikrovalnoj pećnici ili u vodenom kupatilu i doda se otopina etidijevog bromida. Smjesa, ohlađena na 50-60°C, ulijeva se u kalup u sloju debljine 4-6 mm i posebnim češljevima se prave džepovi u gelu za nanošenje uzorka. Češljevi se postavljaju na način da između dna jažica i baze gela ostane sloj agaroze od 0,5-1 mm. Nakon što se gel stvrdne, pojačalo se nanosi na džepove u količini od 5-15 μl. Preporučuje se izvođenje elektroforeze mješavine markera dužine DNK fragmenta paralelno s kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Tipično, takva mješavina sadrži deset fragmenata DNK dužine 100, 200, 300, itd. parova baza.

Korištenje ovakvog testa omogućava verifikaciju dužine amplikona u kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Gel sa nanesenim uzorkom se prenosi u komoru za elektroforezu napunjenu puferom, komora se povezuje na izvor napajanja i vrši se elektroforetsko odvajanje produkata amplifikacije u trajanju od 30-45 minuta pri jakosti električnog polja od 10-15 V/ cm. U tom slučaju, prednji dio boje uključen u reakcijsku smjesu mora se kretati najmanje 3 cm.

Nakon što je elektroforeza završena, gel se prenosi u stakleni transiluminator i gleda pod ultraljubičastim svjetlom. Za dokumentaciju, gel se fotografiše na Micrat 300 filmu ili snima pomoću video sistema spojenog na računar.

Prije svega, procjenjuju se kontrolni uzorci. Narandžasta svijetleća traka trebala bi biti prisutna u elektroforetskoj stazi koja odgovara pozitivnoj kontroli. Njegova elektroforetska pokretljivost mora odgovarati dužini amplikona navedenoj u uputama.

U elektroforetskoj stazi koja odgovara negativnoj kontroli, takva traka bi trebala biti odsutna. Prisustvo takve trake u negativnoj kontroli ukazuje na kontaminaciju – kontaminaciju reagensa korišćenih sa test DNK ili amplikonom. Test uzorci se ocjenjuju prisustvom trake na odgovarajućoj stazi, koja se nalazi na istom nivou kao i traka u uzorku pozitivne kontrole. Intenzitet trake odgovara količini DNK koja se testira u uzorku, što omogućava polukvantitativnu procjenu PCR-a. Obično pozitivni rezultati ocijenjeno na skali od četiri stepena. Ako je sjaj trake u ispitnom uzorku vrlo slab, onda takav uzorak treba preurediti (slika 12).

Rice. 12. Elektroforeza u agaroznom gelu.

Primjena PCR zadijagnostika tačkastih mutacija i polimorfizama gena

Jedno od vodećih područja primjene PCR-a u praktičnoj zdravstvu je dijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena. . Postoje direktne i indirektne metode DNK dijagnostike. U situacijama kada je poznat gen čije oštećenje dovodi do razvoja nasljedne bolesti, ovo oštećenje se može otkriti molekularno genetskim metodama. Takve metode se nazivaju direktnim. Direktnim metodama otkrivaju se nepravilnosti u primarnoj sekvenci nukleotida DNK (mutacije i njihovi tipovi). Direktne metode odlikuju se preciznošću koja dostiže gotovo 100%.

Međutim, u praksi se ove metode mogu koristiti pod određenim uslovima:

· sa poznatom citogenetskom lokalizacijom gena odgovornog za nastanak nasledne bolesti;

· gen bolesti mora biti kloniran i poznata njegova nukleotidna sekvenca.

Svrha direktne DNK dijagnostike je identifikacija mutantnih alela.

Tako se u situacijama kada se zna kakvo oštećenje DNK dovodi do nasljedne bolesti, direktno se ispituje DNK fragment koji sadrži oštećenje, odnosno koristi se direktna dijagnostička metoda DNK.

Međutim, do danas geni mnogih bolesti nisu mapirani, njihova egzon-intronska organizacija je nepoznata, a mnoge nasljedne bolesti karakterizira naglašena genetska heterogenost, što ne dozvoljava potpunu primjenu direktnih DNK dijagnostičkih metoda. Stoga se u slučajevima kada je lokalizacija oštećenja nepoznata, koristi se drugi pristup, koji se odnosi na proučavanje blizine gena odgovornog za bolest gena, u kombinaciji sa porodičnom analizom, odnosno indirektnim metodama molekularno-genetske dijagnoze bolesti. koriste se nasljedne bolesti.

Različite metode se mogu koristiti za otkrivanje točkastih mutacija i malih delecija, ali sve se oslanjaju na PCR metodu. Ova reakcija vam omogućava da umnožite sekvencu nukleotida DNK mnogo puta, a zatim tražite mutacije. Metode za traženje fragmenata DNK koji nose mutacije su zasnovane na komparativna analiza mutantne i normalne DNK nukleotidne sekvence.

Analiza PCR proizvoda

u procesu direktne DNK dijagnostike

Uključuje proučavanje specifičnih karakteristika amplificiranog genskog regiona. Dakle, kod bolesti uzrokovanih ekspanzijom trinukleotidnih ponavljanja, proizvodi amplifikacije se razlikuju po dužini (što odražava različit broj tripleta u proučavanom genskom području) i, kao posljedicu, po brzini kretanja u gelu. Zahvaljujući tome postiže se jasno elektroforetsko razdvajanje normalnih i mutantnih alela i precizno određivanje patološki izduženog fragmenta, odnosno DNK dijagnostika bolesti (Sl. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Rice. 14. Dijagnoza delecije GAG u genu DYT 1 kod pacijenata sa dopa nezavisnom distonijom (elektroforeza na poliakrilamidnom gelu). Trake 2,3,6 – bolesni; staze 1,4,5 – kontrola. Tanka strelica označava normalan alel, debela strelica označava mutantni kraći alel (brisanje tri nukleotida).

Ako je cijela DNK regija koja se proučava dio proširene delecije, tada PCR amplifikacija DNK iz ovog izbrisanog alela neće biti provedena zbog nedostatka mjesta za hibridizaciju prajmera. U ovom slučaju, homozigotna delecija će se dijagnosticirati na osnovu potpunog odsustva produkta PCR reakcije (sinteza DNK je nemoguća iz obje kopije gena). Kod heterozigotne delecije moguće je detektirati PCR proizvod sintetiziran iz normalnog (zadržanog) alela, međutim, za pouzdanu dijagnozu takve mutacije potrebno je koristiti složenije metode snimanja DNK koje omogućavaju procjenu doze konačne PCR; proizvod.

Za identifikaciju tačkastih mutacija (najčešće supstitucije nukleotida) na određenim mjestima koristi se PCR metoda u kombinaciji s drugim metodama molekularne genetičke analize. Ako su lokacija i priroda navodne tačkaste mutacije precizno poznate, onda je restrikcijske endonukleaze (restrikcijskim enzimima) su posebni stanični enzimi izolirani iz različitih sojeva bakterija.

Ovi enzimi prepoznaju specifične nukleotidne sekvence u rasponu od četiri do deset nukleotida u dužini. Nakon toga se vrši restrikcija (lat. (rezanje)) ovih sekvenci kao dijela dvolančane DNK molekule. Svaki restrikcijski enzim prepoznaje i na fiksnom mjestu seče strogo definiranu, specifičnu nukleotidnu sekvencu. restriktivno mjesto (mjesto za prepoznavanje).

U slučajevima kada tačkasta mutacija promijeni prirodno mjesto prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, ovaj enzim neće moći odcijepiti mutantni fragment amplificiran PCR-om. U nekim slučajevima, mutacija dovodi do pojave novog mjesta prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim koji je normalno odsutan.

U obje situacije, mutantni i normalni PCR produkti tretirani odabranim restrikcijskim enzimom će proizvesti restrikcijske fragmente različite dužine, koji se mogu lako detektirati elektroforezom (slika 15).

Dakle, ako je potrebno brzo otkriti bilo koju specifičnu točkastu mutaciju, zadatak se svodi na traženje odgovarajućeg restrikcijskog enzima čije je mjesto prepoznavanja lokalizirano na mjestu poremećene sekvence nukleotida. Tretman PCR proizvoda takvim restrikcijskim enzimom omogućit će lako razlikovanje normalnih i mutantnih alela. Restrikciona analiza uvelike pojednostavljuje otkrivanje poznatih tačkastih mutacija i sada se široko koristi za direktnu DNK dijagnozu nasljednih bolesti.

Završna faza molekularna genetska analiza mutacija je određivanje nukleotidne sekvence fragmenta DNK koji se proučava (sekvenciranje), koji se upoređuje sa normom i formuliše konačna genetska dijagnoza. Zahvaljujući uspjesima molekularne genetike, danas su razvijene DNK dijagnostičke metode za više od 400 nasljednih bolesti.

Rice. 15. Detekcija tačkaste mutacije pomoću restrikcijske analize: A – amplificirana genska regija koja sadrži restrikcijsko mjestoAGCTza restrikcijsku endonukleazuAlu I. MutacijaG→ Amijenja ovu nukleotidnu sekvencu, što rezultira restrikcijskim enzimomAluIblokiran; B – elektroferogram restrikcijskih produkata: kolosek 1 – homozigotnost za normalni alel; kolosijek 2 – homozigotnost za mutaciju; kolosijek 3 – heterozigotno stanje (normalan alel + mutacija).

Dijagnoza nasljednih bolesti, zasnovana na direktnom ispitivanju mutantnih alela kod pacijenata, članova njihovih porodica ili sumnjivih heterozigotnih nosilaca patoloških mutacija, pogodna je za predsimptomatsku i prenatalnu dijagnostiku, koja se može primijeniti u najranijim fazama fetalnog razvoja, prije pojavu bilo kakvih kliničkih ili biohemijskih simptoma bolesti.

Bez obzira na metodu detekcije mutacija, tačne molekularne karakteristike svake mutacije mogu se dobiti samo direktnim sekvenciranjem. Za automatizaciju ovog procesa posljednjih godina uveliko se koriste posebni uređaji - sekvenceri, koji omogućavaju značajno ubrzanje procesa čitanja DNK informacija.

Put za više široka primena Molekularno biološka istraživanja u kliničko-dijagnostičkim laboratorijama otvaraju ubrzanje analitičkog procesa izvođenjem svih postupaka u jednom kontinuumu, bez prijenosa uzorka, stvarajući uslove za sprječavanje kontaminacije pri paralelnom ispitivanju većeg broja analita i uz objektivno bilježenje rezultata u svakom ciklusu.

Glavne modifikacije PCR metode

Koristi se za brzo skeniranje i traženje poznatih genskih mutacija.

Multipleks (multi-primer) PCR

Ova metoda se zasniva na istovremenoj amplifikaciji nekoliko egzona ispitivanog gena u jednoj reakciji. Ovo omogućava ekonomičan brzi skrining najčešćih mutacija. Na primjer, za brzo dijagnosticiranje delecija u genu za distrofin kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom, provodi se simultana amplifikacija skupa najčešće mutiranih egzona ovog gena. Budući da se ove bolesti nasljeđuju na X-vezani recesivni način i da su povezane s oštećenjem jedinog X hromozoma kod dječaka, u slučaju produžene delecije, elektroforeza produkta reakcije će otkriti odsustvo jednog ili više fragmenata DNK (egzona). ), što može poslužiti kao molekularna potvrda dijagnoze. Osim toga, odabirom specifičnih genskih sekcija za PCR amplifikaciju, moguća je prilično precizna procjena ukupne dužine delecije i graničnih tačaka gena (sve do egzona).

Kombinovana upotreba nekoliko multipleksnih reakcija omogućava dijagnosticiranje do 98% svih delecija koje se javljaju kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom. Ovo predstavlja približno 60% od ukupnog broja poznatih mutacija u genu za distrofin i ukazuje na veoma visoku efikasnost ove metode skrininga za DNK dijagnozu distrofinopatija (Sl. 16).

Rice. 16. Direktna DNK dijagnoza Duchenneove mišićne distrofije korištenjem multipleks PCR (agaroznog gel elektroforeza). Kod svake od ispitivanih osoba istovremeno su amplificirana četiri egzona gena za distrofin (egzoni 17, 19, 44 i 45; strelice pokazuju odgovarajuće produkte amplifikacije). Traka 1 – kontrolna, traka 2-5 – pacijenti sa Duchenneovom mišićnom distrofijom sa različitim delecijama gena za distrofin (trake 2 i 5 – delecija egzona 45, staza 3 – delecija egzona 44, staza 4 – delecija egzona 17 i 19 ).

Alel-specifična amplifikacija

Metoda se zasniva na upotrebi dva nezavisna para prajmera za specifičnu regiju gena: jedan prajmer u oba para je uobičajen, a drugi prajmer u svakom paru ima drugačiju strukturu i komplementaran je normalnoj ili mutantnoj DNK sekvenci. Kao rezultat takve reakcije, dvije vrste PCR proizvoda mogu se istovremeno sintetizirati u otopini - normalni i mutantni. Štaviše, dizajn prajmera koji se koristi omogućava jasno razlikovanje normalnih i mutantnih produkata amplifikacije prema njihovoj molekularnoj veličini. Ova metoda je vrlo vizualna i omogućava vam da provjerite i homo- i heterozigotno nošenje mutiranog alela.

Metoda za modifikaciju amplificirane DNK usmjerene na mjesto

Metoda se zasniva na upotrebi takozvanog mismatch prajmera u PCR-u (koji nije u potpunosti komplementaran šablonu), koji se od šablonske DNK sekvence razlikuje za jedan nukleotid. Kao rezultat uključivanja navedenog prajmera u mutantni PCR proizvod, u njemu se formira umjetno stvoreno restrikcijsko mjesto za jednu od restrikcijskih endonukleaza, što omogućava direktnu DNK dijagnozu određene poznate mutacije pomoću restrikcijske analize. Stvaranje takvog umjetnog restriktivnog mjesta je neophodno ako pretraga nije otkrila postojanje poznatog i dostupnog enzima, čije je „prirodno” restriktivno mjesto pogođeno kao rezultat pojave mutacije koja se proučava u molekuli DNK. .

PCR metoda reverzne transkriptaze (RT- PCR)

Ova metoda se koristi u slučajevima kada je prikladnije koristiti ne genomsku DNK kao predmet proučavanja, već kompaktniju i informacijski bogatiju cDNK dobijenu nakon odgovarajuće obrade uzoraka tkiva, na primjer, biopsijskog materijala ili staničnih linija limfocita, fibroblasti, itd. Važan uslov ovdje je ekspresija (barem minimalna) željenog gena u tkivu koje se proučava.

U prvoj fazi se vrši reverzna transkripcija mRNA, a rezultirajući molekuli cDNK služe kao šablon za PCR. Nakon toga, kritični region cDNK, amplificiran u dovoljnoj količini, podvrgava se sekvenciranju i drugim metodama skrininga mutacija, direktnoj elektroforetskoj studiji (detekcija delecija, insercija, itd.) ili integraciji u sistem ekspresije kako bi se dobio proteinski proizvod i njegovu direktnu analizu.

Ova metoda je posebno efikasna za otkrivanje mutacija koje dovode do sinteze „skraćenog“ proteina (besmislene mutacije, mutacije spajanja, velike delecije) – takozvana PTT analiza (Protein Truncation Test). PTT analiza se obično koristi u proučavanju dugih multi-egzonskih gena, kao što su Duchenne/Beckerova mišićna distrofija, ataksija-telangiektazija ili neurofibromatoza tipa 1.

PCR u realnom vremenu(PCR u realnom vremenu, engleski)

Svake godine PCR u realnom vremenu postaje sve popularnija dijagnostička metoda u praktičnoj zdravstvenoj zaštiti. Njegova osnovna karakteristika je praćenje i kvantitativna analiza akumulacije proizvoda lančane reakcije polimeraze i automatska registracija i interpretacija dobijenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva fazu elektroforeze, što smanjuje zahtjeve za PCR laboratorijom. Zahvaljujući uštedi proizvodnog prostora, smanjenju broja osoblja i potražnje kvantifikacija DNK/RNA ova metoda se posljednjih godina uspješno koristi u najvećim sanitarno-epidemiološkim, dijagnostičkim i istraživačkim centrima u razvijenim zemljama svijeta, zamjenjujući PCR u sadašnjem („klasičnom“) formatu.

PCR u realnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK dok se umnožava. PCR u realnom vremenu omogućava potpunu analizu uzorka u roku od 20-60 minuta i teoretski je sposoban detektirati čak i jedan DNK ili RNK molekul u uzorku.

Rice. 17. PCR u realnom vremenu.

PCR u realnom vremenu koristi TaqMan sistem koji kontroliše PCR kinetiku direktno tokom amplifikacije koristeći gašenje rezonancije fluorescencije. Za detekciju se koristi sonda koja nosi fluorofor i gasitelj komplementaran srednjem dijelu amplificiranog fragmenta. Kada su fluorofor i gasitelj vezani za oligonukleotidnu sondu, uočava se samo manja fluorescentna emisija. Tokom procesa amplifikacije, zbog 5" egzonukleazne aktivnosti Taq polimeraze, fluorescentna oznaka odlazi u rastvor, oslobođena od svoje blizine gasitelju, i generiše fluorescentni signal koji se povećava u realnom vremenu proporcionalno akumulaciji pojačala ( Slika 17).

Glavne prednosti PCR u realnom vremenu u odnosu na PCR sa gel elektroforezom:

· Cela metoda se odvija u jednoj epruveti;

· Metoda traje 1 sat;

· 1-2 radne sobe su dovoljne;

· Uz kvalitativnu ocjenu rezultata, pojavljuje se i mogućnost kvantitativne procjene (npr. prilikom propisivanja antivirusna terapija za AIDS ili virusni hepatitis potrebno je znati virusno opterećenje, odnosno količinu virusa po jedinici, što se daje PCR-om u realnom vremenu);

· Rizik od kontaminacije je naglo smanjen.

Zaključak

PCR metoda je jedna od najčešćih metoda molekularno bioloških istraživanja. Kliničari bi ovu metodu trebali inteligentno koristiti, a ljekar koji odluči da koristi PCR u svom radu mora imati određena znanja o karakteristikama i mogućnostima ove metode. Drugo, mora postojati bliska veza između kliničara i PCR laboratorije. Povratne informacije neophodna za analizu složenih slučajeva i razvoj ispravne dijagnostičke strategije. Treće, PCR analiza nije lijek za dijagnozu (prvenstveno zaraznih bolesti) i ne zamjenjuje postojeće metode istraživanja, već ga samo dopunjuje. I što je najvažnije, PCR ne može zamijeniti intuiciju i analitičko razmišljanje koje liječnik koji očekuje uspjeh mora imati.

P . S . Molekularno biološka istraživanja - mijenjanje smjernica za dijagnozu i liječenje. Upotreba molekularno bioloških metoda povezana je s perspektivom radikalne promjene naglaska u laboratorijskoj dijagnostici. Možda se ne radi samo o pravovremenim informacijama, već o tome da ih dobijete unaprijed. Ako sada laboratorijska istraživanja U većini slučajeva se provode kada se bolest već razvila i liječenje je počelo, tada se očekuje da će molekularno-biološki laboratorijski podaci omogućiti da se utvrdi sklonost osobe određenim vrstama patologije i stepen osjetljivosti na određene lijekove, koji će opravdati prediktivnu, preventivnu i personaliziranu prirodu medicine budućnosti.

PROMJENA DIJAGNOSTIKE I ORIJENTACIJE LIJEČENJA

NASLJEDNE BOLESTI

Danas U budućnosti

Dijagnoza Genetski pasoš

8. Koliko je radnih prostorija potrebno za rad PCR laboratorije sa fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza, PCR u realnom vremenu)?

9. Šta je detekcija?

10. Koje metode DNK dijagnostike postoje?

11. Rad kog enzima je u osnovi PCR?

12. Zašto se zona detekcije mora ukloniti iz drugih radnih područja?

13. Šta je restriktivna lokacija?

14. Koje su razlike između direktne i indirektne DNK dijagnostičke metode?

15. Šta je sekvenciranje?

16. Šta je multipleks PCR?

17. Koje vrste mutacija se određuju PCR-om?

18. Šta je kontaminacija?

19. Koja je suština alel-specifične metode amplifikacije?

20. Uslovi skladištenja PCR materijala?

21. U kom uređaju se pojačava?

22. Šta je metoda PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR)?

23. Šta služi kao materijal za PCR dijagnostiku?

24. Navedite vrste kontaminacije?

Testovi za samopripremu

1. Endonukleazni restrikcijski enzimi:

a) enzimi koji „razbijaju“ DNK na strogo određenim mjestima;

b) enzimi koji spajaju lomove u molekulu DNK;

c) enzimi koji obezbeđuju jedinjenja koja vrše popravku DNK.

2. Amplifikacija gena:

3. Koja metoda molekularne genetike se koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih mutiranim genom poznate sekvence?

a) upotreba specifičnog restriktivnog enzima;

b) direktna detekcija upotrebom specifičnih molekularnih sondi;

c) porodična analiza distribucije polimorfizama dužine normalnih restrikcijskih fragmenata.

4. DNK sekvenciranje:

a) identifikacija sekvence baze DNK;

b) višestruko ponavljanje bilo kojeg dijela DNK;

c) izolacija fragmenta DNK koji sadrži gen koji se proučava.

5. Za dobijanje DNK uzoraka možete koristiti :

b) horionske resice;

c) amnionska tečnost;

d) ćelije amnionske tečnosti;

e) biopsijski uzorci kože, mišića, jetre,

e) sve je tačno osim tačke "c",

g) sve je tačno osim tačke “d”,

h) sve gore navedeno je tačno.

6. Za dijagnosticiranje koje se mutacije koristi PCR metoda:

a) genomski;

b) hromozomski;

c) gen (tačka).

7. Prajmer je:

a) komplementarni dio DNK;

b) sintetički oligonukleotid označen (radioaktivno ili fluorescentno) sekvencu komplementarnu mutantnom ili normalnom genu;

c) oligonukleotid koji djeluje kao “prajmer” i inicira sintezu polinukleotidnog lanca na DNK ili RNK matrici.

8. Ko je razvio princip PCR metode?

b) K. Mullis

9. Koristi li se PCR metoda za dijagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja (dinamički tip mutacije)?

10. U kojim oblastima se koristi PCR?

a) klinička medicina;

b) određivanje transgenih organizama (GMO)

c) lična identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

d) sve gore navedeno,

e) ništa od navedenog..

Primjeri odgovora: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – u; 7 – u; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Main

1.Bočkova genetika. Moskva. GEOTAR, 2002.

Dodatno

1. , Bakharev i liječenje urođenih i nasljednih bolesti kod djece. – Moskva, 2004.

2. DNK dijagnostika i medicinsko genetičko savjetovanje. – Moskva, 2004.

3. Ginter genetika. – Moskva, 2003.

4. Gorbunov osnove medicinske genetike. – Sankt Peterburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularna klinička dijagnostika. – Svijet, 1999.

6. Menšikov - biološka istraživanja u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici: mogućnosti problema (predavanja). Klinički laboratorijska dijagnostika, № 3, 2006.

7. Kornienkov rad u PCR laboratoriji tokom in-line analize biološkog materijala. Klinička laboratorijska dijagnostika, br. 10, 2006.

8. Organizacija rada PCR laboratorije. Metodička uputstva. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni doktor Ruske Federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativni PCR u realnom vremenu. Genome Res. – br. 6, 1996.

OSNOVNI PRINCIPI METODE

POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA

Metodički priručnik za vannastavni rad studenata 3-4 godine na specijalnostima opšte medicine (060101) i pedijatrije (060103).

Državna obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Krasnojarska državna medicinska akademija Federalne agencije za zdravstvo i socijalni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,

1. Lančana reakcija polimeraze (PCR)

2. Princip metode polimerazne lančane reakcije

2.1 Prisustvo određenog broja komponenti u reakcionoj smeši

2.2 Ciklični temperaturni režim

2.3 Osnovni principi za odabir prajmera

2.4 Efekat platoa

3. Faze PCR

3.2 Pojačanje

3.4.1 Pozitivne kontrole

3.4.2 Interne kontrole

4.1 Kvalitativna analiza

4.1.2 Detekcija RNA molekula

3.1 Priprema biološkog uzorka

Za izolaciju koristi se DNK razne tehnike zavisno od postavljenih zadataka. Njihova suština je u ekstrakciji (ekstrakciji) DNK iz biološkog preparata i uklanjanju ili neutralizaciji stranih nečistoća kako bi se dobio DNK preparat čistoće pogodne za PCR.

Metoda za dobivanje čistog DNK preparata koju je opisao Marmur smatra se standardnom i već je postala klasična. Uključuje enzimsku proteolizu praćenu deproteinizacijom i reprecipitacijom DNK alkoholom. Ova metoda vam omogućava da dobijete čist DNK preparat. Međutim, prilično je radno intenzivan i uključuje rad s takvim agresivnim tvarima jakog mirisa kao što su fenol i kloroform.

Jedna od trenutno popularnih metoda je metoda ekstrakcije DNK koju su predložili Boom et al. Ova metoda se zasniva na upotrebi jakog haotropnog sredstva, gvanidin tiocijanata (GuSCN), za lizu ćelija i naknadnu sorpciju DNK na nosaču (staklene perle, dijatomejska zemlja, stakleno mleko itd.). Nakon ispiranja, DNK ostaje u uzorku, sorbiran na nosaču, iz kojeg se lako uklanja pomoću pufera za eluiranje. Metoda je zgodna, tehnološki napredna i pogodna za pripremu uzorka za amplifikaciju. Međutim, gubitak DNK je moguć zbog ireverzibilne sorpcije na nosaču, kao i tokom brojnih pranja. Ovo je posebno važno kada se radi sa malim količinama DNK u uzorku. Osim toga, čak i količine GuSCN u tragovima mogu inhibirati PCR. Stoga je pri korištenju ove metode vrlo važno pravi izbor sorbent i pažljivo pridržavanje tehnoloških nijansi.

Druga grupa metoda pripreme uzoraka zasniva se na upotrebi ionskih izmjenjivača tipa Chilex, koji, za razliku od stakla, ne upijaju DNK, već nečistoće koje ometaju reakciju. U pravilu, ova tehnologija uključuje dvije faze: ključanje uzorka i sorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvođenja. U većini slučajeva pogodan je za rad sa kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci sa nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki mikroorganizmi se ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U tim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzorka.

Stoga, izbor metode pripreme uzorka treba uzeti u obzir uz razumijevanje svrhe namjeravane analize.

3.2 Pojačanje

Za izvođenje reakcije amplifikacije potrebno je pripremiti reakcionu smjesu i dodati joj analizirani uzorak DNK. Važno je uzeti u obzir neke karakteristike žarenja prajmera. Činjenica je da, po pravilu, analizirani biološki uzorak sadrži različite molekule DNK, na koje prajmeri korišteni u reakciji imaju djelomičnu, au nekim slučajevima i značajnu homologiju. Osim toga, prajmeri se mogu žariti jedan s drugim, formirajući dimere prajmera. Oba dovode do značajne potrošnje prajmera za sintezu nusproizvoda (nespecifičnih) reakcijskih proizvoda i, kao rezultat, značajno smanjuju osjetljivost sistema. To otežava ili onemogućava očitavanje rezultata reakcije tokom elektroforeze.

3.3 Procjena rezultata reakcije

Za ispravnu procjenu rezultata PCR-a, važno je razumjeti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, proizvodi amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNK mogu se detektovati elektroforezom nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uslovima bliskim idealnim, što nije čest slučaj u životu. Posebno veliki uticaj Na efikasnost amplifikacije utiče stepen čistoće DNK preparata, tj. prisutnost u reakcijskoj smjesi određenih inhibitora, kojih se u nekim slučajevima može biti izuzetno teško riješiti. Ponekad, zbog njihovog prisustva, čak i desetine hiljada ciljnih molekula DNK ne mogu se umnožiti. Stoga često ne postoji direktna veza između početne količine ciljne DNK i konačne količine produkata amplifikacije.

3.3.1 Metoda horizontalne elektroforeze

Za vizualizaciju rezultata amplifikacije koriste se različite metode. Najčešća metoda danas je elektroforeza, zasnovana na razdvajanju molekula DNK po veličini. Da biste to učinili, pripremite ploču agaroznog gela, koja je očvrsnuta agarozom nakon topljenja u puferu za elektroforezu u koncentraciji od 1,5-2,5% uz dodatak posebne DNK boje, na primjer, etidijum bromida. Učvršćena agaroza formira prostornu rešetku. Prilikom izlijevanja pomoću češljeva, u gelu se formiraju posebne jažice u koje se naknadno dodaju proizvodi za pojačavanje. Gel ploča se postavlja u horizontalni aparat za gel elektroforezu i priključuje se izvor konstantnog napona. Negativno nabijena DNK počinje da se kreće u gelu od minusa do plusa. U ovom slučaju, kraći molekuli DNK kreću se brže od dužih. Na brzinu kretanja DNK u gelu utiču koncentracija agaroze, jačina električnog polja, temperatura, sastav pufera za elektroforezu i, u manjoj meri, GC sastav DNK. Svi molekuli iste veličine kreću se istom brzinom. Boja je ugrađena (interkalirana) planarnim grupama u molekule DNK. Nakon završene elektroforeze, koja traje od 10 minuta do 1 sat, gel se postavlja na transiluminator filter koji emituje svjetlost u ultraljubičastom opsegu (254 - 310 nm). Ultraljubičasta energija koju apsorbuje DNK na 260 nm prenosi se na boju, uzrokujući da ona fluorescira u narandžasto-crvenoj oblasti vidljivog spektra (590 nm).

Svjetlina traka proizvoda za pojačanje može varirati. Međutim, to se ne može povezati sa početnom količinom ciljne DNK u uzorku.

3.3.2 Metoda vertikalne elektroforeze

Metoda vertikalne elektroforeze u osnovi je slična horizontalnoj elektroforezi. Njihova razlika je u tome što se u ovom slučaju umjesto agaroze koriste poliakrilamidni gelovi. Izvodi se u posebnoj komori za vertikalnu elektroforezu. Elektroforeza na poliakrilamidnom gelu ima veću rezoluciju u odnosu na elektroforezu agaroze i omogućava razlikovanje molekula DNK različitih veličina sa tačnošću od jednog nukleotida. Priprema poliakrilamidnog gela je nešto složenija od agaroznog gela. Osim toga, akrilamid je toksična supstanca. Budući da se rijetko javlja potreba za određivanjem veličine proizvoda amplifikacije s točnošću od 1 nukleotida, u rutinskom radu koristi se metoda horizontalne elektroforeze.

3.4 Praćenje napretka reakcije amplifikacije

3.4.1 Pozitivne kontrole

Kao “pozitivna kontrola” koristi se DNK preparat željenog mikroorganizma. Nespecifični amplikoni se razlikuju po veličini od amplikona nastalih kao rezultat amplifikacije s kontrolnim DNK preparatom. Nespecifični proizvodi mogu biti veće ili manje veličine u odnosu na pozitivnu kontrolu. U najgorem slučaju, ove veličine se mogu poklapati i čitaju se kao pozitivne u elektroforezi.

Da biste kontrolisali specifičnost rezultirajućeg produkta amplifikacije, možete koristiti hibridizacijske sonde (odsječke DNK smještene unutar amplificirane sekvence), označene enzimskim oznakama ili radioaktivnim izotopima i koje stupaju u interakciju s DNK u skladu s istim principima kao prajmeri. To značajno komplikuje i produžava analizu, a njen trošak značajno raste.

3.4.2 Interne kontrole

Potrebno je pratiti napredak amplifikacije u svakoj epruveti sa reakcionom smjesom. U tu svrhu koristi se dodatna, takozvana „interna kontrola“. To je bilo koji DNK preparat koji je različit od DNK željenog mikroorganizma. Ako se u reakcionu smjesu doda interna kontrola, ona će postati ista meta za žarenje prajmera kao hromozomska DNK željenog infektivnog agensa. Veličina internog kontrolnog amplifikacionog proizvoda odabrana je tako da bude 2 ili više puta veća od amplikona nastalih umnožavanjem DNK željenog mikroorganizma. Kao rezultat toga, ako se u reakcionu smjesu uz test uzorak doda interna kontrola DNK, tada će, bez obzira na prisustvo mikroorganizma u biološkom uzorku, interna kontrola uzrokovati stvaranje specifičnih amplikona, ali znatno duže (teže) nego amplikon mikroorganizma. Prisustvo teških amplikona u reakcijskoj smjesi će ukazati na normalan napredak reakcije amplifikacije i odsustvo inhibitora. Ukoliko se ne formiraju amplikoni potrebne veličine, ali se ne formiraju i interni kontrolni amplikoni, možemo zaključiti da u analiziranom uzorku postoje nepoželjne nečistoće koje treba eliminisati, ali ne o odsustvu željene DNK.

Nažalost, uprkos svoj atraktivnosti ovog pristupa, on ima značajnu manu. Ako je željena DNK prisutna u reakcionoj smjesi, tada se efikasnost njene amplifikacije naglo smanjuje zbog konkurencije s internom kontrolom za prajmere. Ovo je posebno važno pri niskim koncentracijama DNK u uzorku za testiranje, što može dovesti do lažno negativnih rezultata.

Međutim, pod uslovom da se reši problem konkurencije za prajmere, ova metoda praćenja efikasnosti amplifikacije će svakako biti veoma korisna.

4. Metode bazirane na lančanoj reakciji polimeraze

4.1 Kvalitativna analiza

Klasična metoda izvođenja PCR-a, čiji su principi gore navedeni, razvijena je u nekim modifikacijama u cilju prevazilaženja ograničenja PCR-a i povećanja efikasnosti reakcije.

4.1.1 Metoda izvođenja PCR-a pomoću „hot starta“

Da bi se smanjio rizik od stvaranja nespecifičnih produkata reakcije amplifikacije, koristi se pristup koji se naziva „Hot-start“ i njegova suština je da se spriječi početak reakcije dok se ne postignu uvjeti u epruveti koji osiguravaju specifično žarenje prajmera.

Činjenica je da, ovisno o sastavu i veličini GC-a, prajmeri imaju određenu temperaturu topljenja (Tm). Ako temperatura sistema premašuje Tm, prajmer nije u stanju da prione na lanac DNK i denaturira. U skladu sa optimalnim uslovima, tj. Sa temperaturom žarenja blizu temperature topljenja, prajmer formira dvolančanu molekulu samo ako je potpuno komplementaran i tako osigurava specifičnost reakcije.

Postoje različite opcije za implementaciju "hot starta":

Dodavanje Taq polimeraze u reakcionu smjesu tokom prvog ciklusa nakon zagrijavanja cijevi do temperature denaturacije.

Razdvajanje sastojaka reakcione smjese parafinskim slojem u slojeve (u donjem dijelu - prajmeri, u gornjem dijelu - Taq polimeraza i DNK mete), koji se miješaju kada se parafin topi (~ 65-75 0 C).

Upotreba monoklonskih antitijela na Taq polimerazu. Enzim vezan monoklonskim antitijelima postaje aktivan tek nakon prve faze denaturacije, kada se monoklonska antitijela ireverzibilno denaturiraju i oslobađaju aktivna mjesta Taq polimeraze.

U svim gore navedenim slučajevima, čak i ako je do nespecifičnog žarenja došlo prije početka temperaturnog ciklusa, ne dolazi do elongacije, a zagrijavanjem se denaturiraju kompleksi prajmer-DNK, pa se ne stvaraju nespecifični produkti. Nakon toga, temperatura u epruveti ne pada ispod temperature topljenja, što osigurava stvaranje specifičnog produkta pojačanja.

4.1.2 Detekcija RNA molekula

Mogućnost korištenja RNK kao mete za PCR značajno proširuje opseg primjene ove metode. Na primjer, genomi mnogih virusa (hepatitis C, virus gripe, pikornavirusi, itd.) su predstavljeni RNK. Štaviše, u njihovim životnim ciklusima ne postoji međufaza transformacije u DNK. Da bi se otkrila RNK, ona se prvo mora pretvoriti u oblik DNK. Za to se koristi reverzna transkriptaza, koja je izolirana iz dva različita virusa: virusa ptičje mijeloblastoze i Moloney virusa mišje leukemije. Upotreba ovih enzima predstavlja određene poteškoće. Prije svega, oni su termolabilni i stoga se mogu koristiti na temperaturama ne višim od 42°C. Kako na ovoj temperaturi molekule RNK lako formiraju sekundarne strukture, efikasnost reakcije značajno opada i, prema različitim procjenama, iznosi oko 5%. Pokušava se zaobići ovaj nedostatak korištenjem termostabilne polimeraze dobijene od termofilnog mikroorganizma Thermus Thermophilus, koji pokazuje aktivnost transkriptaze u prisustvu Mn 2+, kao reverzne transkriptaze. To je jedini poznati enzim sposoban da ispoljava i polimerazu i aktivnost transkriptaze.

Za izvođenje reakcije reverzne transkripcije, reakciona smjesa, baš kao i kod PCR-a, mora sadržavati prajmere kao prajmer i mješavinu 4 dNTP kao građevinski materijal.

Nakon izvođenja reakcije reverzne transkripcije, rezultirajući molekuli cDNK mogu poslužiti kao meta za PCR

5. Organizacija tehnološkog procesa izvođenja PCR-a

Potencijalno visoka osjetljivost lančane reakcije polimeraze čini posebno pažljiv dizajn PCR laboratorija apsolutno neophodnim. Tome je zaslužno najviše akutni problem metoda - kontaminacija.

Kontaminacija je ulazak iz vanjskog okruženja u reakcijsku smjesu specifičnih molekula DNK koji mogu poslužiti kao mete u reakciji amplifikacije i dati lažno pozitivne rezultate.

Postoji nekoliko načina za borbu protiv ove neprijatne pojave. Jedna od njih je upotreba enzima N-uracil glikozilaze (UG). Ova metoda se zasniva na sposobnosti UG da cijepa molekule DNK sa ugrađenim uracilom. Reakcija amplifikacije se izvodi pomoću dNTP mješavine u kojoj je dTTP zamijenjen uracilom, a nakon termičkog ciklusa, svi amplikoni formirani u epruveti će sadržavati uracil. Ako se CG doda u reakcionu smjesu prije amplifikacije, tada će amplikoni koji ulaze u reakcionu smjesu biti uništeni, dok će nativna DNK ostati netaknuta i kasnije će služiti kao meta za amplifikaciju.

Dakle, ova metoda samo u određenoj mjeri eliminira izvor kontaminacije i ne garantira lažno pozitivne rezultate.

Drugi način za suzbijanje rezultata kontaminacije je značajno smanjenje broja reakcionih ciklusa (do 25-30 ciklusa). Ali čak i uz ovaj pristup, rizik od dobivanja lažno pozitivnih rezultata je visok, jer je u ovom slučaju, u nedostatku inhibitora, lako dobiti proizvod za pojačavanje zbog kontaminacije.

Stoga, uprkos prednostima mjera preamplifikacije usmjerenih na inaktivaciju molekula DNK koji uzrokuju lažno pozitivne rezultate, najradikalniji lijek je dobro osmišljena laboratorijska organizacija.

Zaključak

Najviše široku upotrebu PCR metoda je sada postala metoda za dijagnosticiranje raznih zaraznih bolesti. PCR vam omogućava da identificirate etiologiju infekcije čak i ako uzorak uzet za analizu sadrži samo nekoliko molekula DNK patogena. PCR se široko koristi u ranoj dijagnostici HIV infekcija, virusnih hepatitisa itd. Danas gotovo da nema infektivnog uzročnika koji se ne može otkriti PCR-om.